白眉蝮蛇去整合素Adinbitor在毕赤酵母中的表达及对肿瘤细胞的作用

论文摘要

去整合素（disintegrins）为一组源于出血性蛇毒的抗黏附蛋白质的总称,因其可强力拮抗整合素（integrin）而得名。其特征为:富含半胱氨酸,并多含有Arg-Gly-Asp（RGD）或Lys-Gly-Asp（KGD）亲水性氨基酸序列,分子量仅为5～9kD,多为单链蛋白分子[1]。因为大部分细胞整合素（integrins）都能识别RGD序列,而大多数细胞外基质（extracellular matrix,ECM）蛋白成分都含有RGD序列,因此去整合素可凭借其RGD识别序列而成为细胞外基质与整合素间结合的强有力的竞争性拮抗剂,从而抑制整合素参与的多种生理活动。去整合素（Adinbitor）是运用基因工程手段,从产于中国旅顺的白眉蝮蛇（Gloydius blomhoffi brevicaudus）毒腺中获得。即从中国白眉蝮蛇毒腺中提取总RNA进行RT-PCR扩增,根据NCBI上发表的同源序列反推DNA,自行设计引物,获得了219 bp的白眉蝮蛇去整合素基因。去整合素（Adinbitor）由73个氨基酸残基组成,含有12个半胱氨酸残基和一个去整合素特征性RGD三肽识别序列,相对分子量9KD,作为去整合素家族的新成员,可作为多种整合素受体的强有力的拮抗剂,具有抑制肿瘤的作用。整合素（Integrins）是广泛存在于动植物细胞表面的一类细胞黏附分子,它介导细胞与细胞外基质间及细胞与细胞间的相互作用,参与细胞内外信息传递,在细胞分化,胚胎发育,凝血,组织修补及细胞黏附,侵袭等各方面起重要作用。整合素与恶性肿瘤的发生发展密切相关,整合素可通过传递特定的信号或诱导基因表达来调控肿瘤细胞的黏附,增殖,浸润和转移,凋亡以及肿瘤血管的生成等。所有去整合素都具有其生物学活性所必须的RGD特异性识别序列,凭借此序列去整合素可作为多种整合素受体的强有力的拮抗剂,抑制整合素在肿瘤发生过程中的各种作用。目前已经发现去整合素能够抑制肿瘤细胞对纤连蛋白,玻连蛋白,层粘连蛋白和胶原的黏附,从而抑制肿瘤细胞的生长,浸润和转移,同时去整合素还具有诱导肿瘤细胞发生凋亡的特异作用。酵母作为一种后起的外源表达系统,由于兼具原核及真核细胞表达系统的特点,正在基因工程领域得到广泛应用,目前研究比较成熟的是巴斯德毕赤酵母（Pichia pastors,P.pastoris）。毕赤酵母是一种单细胞真核生物,近十年来被作为真核表达系统而用于外源蛋白质的生产。其表达的Adinbitor在结构和功能上更接近天然Adinbitor,有利于大量生产。本论文将已经构建的重组质粒pPIC9K-Adinbitor在毕赤酵母GS115中表达的去整合素（rAdinbitor）,经过层析柱纯化及透析,获得分子量为9KD的去整合素（rAdinbitor）,并对B16黑色素瘤细胞的黏附,增殖,浸润,转移和凋亡方面进行研究。实验结果表明rAdinbitor同样可以抑制肿瘤细胞的黏附,增殖,浸润与转移,同时还可以呈剂量依赖性方式诱导肿瘤细胞发生凋亡。总之,本论文成功的通过基因工程手段从中国旅顺的白眉蝮蛇毒腺中获得了一个去整合素家族的新成员rAdinbitor,并对其对肿瘤细胞的抑制作用进行了研究。结果显示去整合素这一生物活性因子,可作为新型抗肿瘤物质为临床治疗恶性肿瘤开辟了新领域,为人类攻克癌症提供新的手段。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 第一章 去整合素rAdinbitor 的诱导表达、鉴定与纯化
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• （五） 第二章 rAdinbitor 对肿瘤细胞的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• （六） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢