阿尔茨海默病（AD）病原Aβ1-42多肽的高效表达、纯化和寡聚体形成的研究

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer,s disease, AD）是一种进行性记忆丧失和痴呆为特征的神经退行性疾病。其主要病理学特征是脑内神经细胞之间出现大量的β淀粉样纤维（AβPeptide ,Aβ）沉积,形成老年斑（senile plaques, SP）。神经细胞内出现神经纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）。该病的最主要病因及病理机制至今仍不明了,但大量研究显示,Aβ寡聚体在AD的发展过程中起着至关重要的作用,因此针对Aβ寡聚体的免疫治疗对AD存在着潜在的治疗效果。目的:在针对Aβ寡聚体的免疫治疗中,经济、高效、便捷的制备Aβ寡聚体是实验的前提和基础。本课题组通过在原核细胞上成功表达得到Aβ1-42多肽,经鳌合层析纯化后用此多肽来研究Aβ寡聚体形成的条件和方法。为利用Aβ寡聚体制备单抗的AD免疫疗法提供经济有效的原料,从而在AD的免疫治疗方法中探索一条新的路径。同时对两个均含有Aβ1-42多肽片段的不同质粒用相同的方法进行原核表达和重组蛋白的纯化,对比两者的异同点,以筛选出更加合适的Aβ1-42多肽表达质粒。方法:构建含有Aβ1-42多肽的PET30a质粒,将其转入表达菌株BL21中进行表达,并用Ni-NTA Superflow鳌合层析柱对重组蛋白在尿素变性条件下进行纯化,得到一定浓度的Aβ1-42多肽。将纯化后的Aβ1-42多肽经六氟异丙醇（HFIP）、二甲基亚砜（DMSO）和F12培养基逐步溶解,设置不同条件摸索Aβ1-42-F12溶液形成寡聚体的规律,并与其他方法进行对比,从而初步探索出Aβ寡聚体制备的方法和条件。结果:经过多种条件的反复试验,实现了重组蛋白的高效表达和纯化。并且有与Aβ1-42多肽相同的分子量和免疫学活性。用此多肽进一步摸索出寡聚体的形成规律,一定浓度37℃的条件下,在取样第三到四天随着单体的减少,寡聚体逐渐形成,并随时间推移而呈现增多趋势。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 阿尔茨海默病（AD）的概况
• 1.1.1 阿尔茨海默病（AD）的发现及命名
• 1.1.2 阿尔茨海默病（AD）的流行病学和危险因素
• 1.1.3 阿尔茨海默病（AD）的症状
• 1.1.4 阿尔茨海默病（AD）病因和病理机制
• 1.1.5 阿尔茨海默病（AD）的治疗
• 1.2 Aβ及 Aβ寡聚体与AD 关系的研究进展
• 1.3 本研究的目的意义及主要研究内容
• 2 实验一 重组蛋白的原核表达和纯化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 常规试剂及试剂盒
• 2.1.4 抗体试剂
• 2.1.5 溶液及试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 重组蛋白的原核表达
• 2.2.2 表达蛋白的纯化
• 2.2.3 表达、纯化蛋白的 Western blotting 检测
• 2.2.4 纯化蛋白的浓度测定
• 2.3 结果
• 2.3.1 重组质粒酶切鉴定的结果
• 2.3.2 重组质粒诱导表达的SDS/PAGE 电泳结果
• 2.3.3 重组质粒诱导表达的时间优化实验的SDS/PAGE 电泳结果
• 1－42多肽在8M 尿素变性条件下纯化的 SDS'>2.3.4 重组表达的 Aβ_1－42多肽在8M 尿素变性条件下纯化的 SDS
• 1-42 多肽在非变性条件下纯化的 SDS/PAGE 结果'>2.3.5 重组表达的 Aβ_1-42 多肽在非变性条件下纯化的 SDS/PAGE 结果
• 2.3.6 表达纯化蛋白的 Western blot 检测结果
• 1-42多肽浓度测定的 SDS/PAGE 结果'>2.3.7 重组蛋白 Aβ_1-42多肽浓度测定的 SDS/PAGE 结果
• 2.4 分析和讨论
• 2.4.1 影响蛋白表达的因素
• 2.4.2 纯化时的注意事项
• 1-42 寡聚体体外聚合的初步探索'>3 实验二 Aβ_1-42寡聚体体外聚合的初步探索
• 3.1 实验材料和试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 纯化蛋白的酶切实验
• 1-42 PBS 稀释后体外聚合的研究'>3.2.2 原核表达的 Aβ_1-42 PBS 稀释后体外聚合的研究
• 1-42经HFIP-DMSO 溶解后体外聚合的研究'>3.2.3 原核表达的 Aβ_1-42经HFIP-DMSO 溶解后体外聚合的研究
• 1-42体外聚合的探索'>3.2.4 化学合成的 Aβ_1-42体外聚合的探索
• 3.3 结果
• 3.3.1 纯化蛋白酶切的SDS－PAGE 分析
• 1-42体外聚合的结果分析'>3.3.2 原核表达的 Aβ_1-42体外聚合的结果分析
• 1-42体外聚合的 SDS-PAGE 分析'>3.3.3 化学合成的 Aβ_1-42体外聚合的 SDS-PAGE 分析
• 3.4 分析和讨论
• 1-42的体外聚合方法的比较'>3.4.1 原核表达的 Aβ_1-42的体外聚合方法的比较
• 1-42体外聚合失败的分析'>3.4.2 化学合成的 Aβ_1-42体外聚合失败的分析
• 4 实验三 新构建质粒的原核表达和纯化
• 4.1 实验材料和实验方法
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 新质粒的诱导表达的 SDS-PAGE 分析
• 4.2.2 新质粒的表达纯化的 SDS-PAGE 分析
• 4.2.3 新质粒的 Western blotting 分析
• 4.3 讨论和分析
• 5 结论
• 1-42多肽的表达和纯化'>5.1 Aβ_1-42多肽的表达和纯化
• 5.2 寡聚体的体外聚合
• 5.3 两个不同质粒的比较
• 参考文献
• 附录
• 作者简介