RML脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达与发酵优化

论文摘要

工业化酶制剂的品质改良及新品种的开发是现代生物技术介入最多的一个领域,并已取得令人瞩目的成果。DNA重组技术对酶工业的渗透,促进了酶工业的飞跃发展,使酶制剂产品品种增加,质量提高,成本下降,给社会带来了巨大的经济效益。国际上广泛采用基因工程、蛋白质工程等高新技术,大大提高了菌种产酶能力,增加了酶的稳定性,提高了酶在各种环境中的反应效率。脂肪酶是一种广泛存在的水解酶,能催化酯键水解及其逆向反应,即在非水相体系中催化酯合成和转酯反应。由于其催化功能的多样性和作为一种生物催化剂的优越性,脂肪酶在许多领域具有广泛的应用,是最常见的工业用酶之一。但目前脂肪酶工业应用的瓶颈问题是其成本较高,因此构建产酶活力高的工程菌是当前研究的热点。米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）脂肪酶（RML）工业应用较广泛,具有优良的Sn-1立体特异性和催化活性。本研究运用基因工程技术,以毕赤酵母表达RML目标产品,旨在建立毕赤酵母表达异源脂肪酶高效发酵表达工艺。相应研究分为三部分:1). RML脂肪酶的克隆表达与高产菌株的筛选。合成RML基因,并构建分泌型表达载体,扩增后转化毕赤酵母,筛选高产重组菌;2).酵母表达条件优化。在摇瓶中,通过对碳源、氮源浓度优化无机培养基组成,对pH、温度和诱导剂浓度优化,在摇瓶阶段取得较高的细胞密度和蛋白表达量,为后续的重组酶的性质研究奠定基础;3).对重组RML脂肪酶进行性质研究,包括:最适pH值和pH值稳定性、最适温度和热稳定性、金属离子对酶活的影响和底物特异性等,以此考察重组RML脂肪酶的理论研究和工业应用价值。本研究参考己报道的米黑根毛霉脂肪酶前体序列（P19515,GI:417256）设计了一对特异性引物,在上下游引物两端分别引入了SnaBⅠ和AvrⅡ酶切位点,从质粒pGAP-RML中成功扩增出编码RML的成熟肽基因,经双酶切与载体pPIC9K连接,构建了分泌型表达载体pPIC9K-RML。转化E.coli DH 5α,筛选阳性克隆。重组质粒pPIC9K-RML经SalⅠ内切酶线性化,用LiCl法转化整合到组氨酸（HIS4）缺陷型巴斯德毕赤酵母GS115中,并使用抗生素G418筛选、三丁酸甘油酯-MM板及PCR方法筛选获得高表达的重组子。重组子在甲醇诱导下表达产酶,以橄榄油为底物分析脂肪酶的产酶量,并经SDS-PAGE电泳分析,显示表达的脂肪酶分子量大小与预期一致,为36KD。本文进一步优化了发酵条件,包括对培养基组分、诱导剂浓度和发酵温度等的优化。优化后的培养基组成为:甘油4.0%,（NH4）2SO45.0g/L,CaSO4 0.465 g/L,K2SO49.10 g/L,MgSO4·7H2O 7.45 g/L;培养条件为:pH6.0,生长阶段温度30℃,诱导阶段采用22℃低温诱导,诱导期每24h补加甲醇浓度为3%。优化后,发酵液中的RML活力最高达到116U/mL,比优化前提高了3.14倍。对重组脂肪酶RML进行酶学性质分析表明:重组酶的最适反应温度为40℃,最适水解反应pH为8.0;该酶偏爱中长链的脂肪酸酯（C8-C12）,最适反应底物为对硝基苯酚月桂酸酯（C12）,对C16长链脂肪酸酯也有较高的活性,对短链酯的活性较弱;金属离子Cu2+和Fe2+对酶活性有显著抑制作用,Ca2+和Mg2+对酶活有部分的激活作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 脂肪酶简介
• 1.1.1 脂肪酶的定义
• 1.1.2 脂肪酶的来源
• 1.1.3 脂肪酶的结构与催化机理
• 1.1.4 脂肪酶的底物特异性
• 1.1.4.1 位置特异性
• 1.1.4.2 脂肪酸特异性
• 1.1.4.3 立体特异性
• 1.2 脂肪酶的应用
• 1.2.1 生产单甘酯
• 1.2.2 食品工业
• 1.2.3 医药
• 1.2.4 皮革生产
• 1.2.5 纸浆和造纸
• 1.2.6 手性化合物的制备
• 1.2.7 洗涤剂
• 1.3 脂肪酶基因的表达
• 1.3.1 脂肪酶基因在原核细胞中的表达
• 1.3.2 脂肪酶基因在真核细胞中的表达
• 1.4 米黑根毛霉脂肪酶简介
• 1.5 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展
• 1.5.1 常用表达菌株及表达载体
• 1.5.1.1 表达菌株
• 1.5.1.2 表达载体
• 1.5.2 基因整合及表达调控的机理
• 1.5.2.1 基因整合
• 1.5.2.2 调控机制
• 1.5.3 外源基因自身特性对 P.pastoris 表达系统的影响
• 1.5.4 P.pastoris 表达产物的糖基化
• 1.5.4.1 N-和 O-糖基化
• 1.5.4.2 糖基化对蛋白质产量及功能的影响
• 1.5.5 外源蛋白的翻译后修饰
• 1.6 本课题的研究意义与内容
• 1.7 本课题的来源
• 1.8 本课题的主要技术路线
• 第二章 米黑根毛霉脂肪酶基因的克隆和表达载体的构建
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与仪器
• 2.2.1 菌种和质粒
• 2.2.2 主要生化试剂
• 2.2.3 主要实验仪器
• 2.2.4 溶液和培养基
• 2.3 技术路线
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 目的基因的获得
• 2.4.1.1 PCR 引物设计
• 2.4.1.2 质粒pGAP-RML 的抽提
• 2.4.1.3 Rhizomucor miehei Lipase 基因的扩增
• 2.4.1.4 琼脂糖凝胶电泳
• 2.4.1.5 PCR 产物纯化
• 2.4.1.6 纯化后的 PCR 产物双酶切
• 2.4.1.7 酶切后目的产物的凝胶回收
• 2.4.2 表达载体pPIC9K-RML 的构建
• 2.4.2.1 质粒pPIC9K 的提取
• 2.4.2.2 载体pPIC9K 的双酶切及其纯化
• 2.4.2.3 目的基因 RML 与载体pPIC9K 的体外连接
• 2.4.3 重组质粒的获得
• 2.4.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.4.3.2 重组质粒pPIC9K-RML 的转化
• 2.4.4 重组质粒的鉴定
• 2.4.5 重组质粒中目的基因序列的测定
• 2.5 实验结果与分析
• 2.5.1 Rhizomucor miehei Lipase 基因的扩增结果
• 2.5.2 重组质粒的构建和双酶切鉴定
• 2.5.3 重组质粒的基因序列测定结果
• 2.6 小结
• 第三章 米黑根毛霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与仪器
• 3.2.1 菌种和质粒
• 3.2.2 主要生化试剂
• 3.2.3 主要实验仪器
• 3.2.4 溶液和培养基
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 毕赤酵母重组表达载体的构建
• 3.3.2 重组质粒的线性化
• 3.3.3 毕赤酵母感受态细胞的制备及转化
• 3.3.3.1 毕赤酵母感受态细胞的制备
• 3.3.3.2 毕赤酵母的转化
• 3.3.4 重组子的筛选
• +Mut⁺阳性克隆的筛选'>3.3.4.1 His⁺Mut⁺阳性克隆的筛选
• 3.3.4.2 三丁酸甘油酯平板活性筛选高表达转化子
• 3.3.4.3 G418 筛选高拷贝转化子
• 3.3.4.4 三丁酸甘油酯平板活性筛选高表达转化子
• 3.3.5 甲醇诱导脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
• 3.3.6 表达产物的 SDS-PAGE 电泳检测
• 3.3.7 表达产物酶活的测定
• 3.3.7.1 橄榄油乳化法
• 3.3.7.2 对硝基苯酚比色法（p-NPL 法）测定脂肪酶活性[80]
• 3.4 实验结果与分析
• 3.4.1 酵母重组子的筛选
• 3.4.2 初步发酵实验
• 3.5 小结与讨论
• 3.5.1 小结
• 3.5.2 讨论
• 第四章 毕赤酵母重组菌发酵条件的优化
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 实验菌株
• 4.2.2 主要生化试剂
• 4.2.3 主要实验仪器
• 4.2.4 培养基
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 重组菌生长曲线和pH 值曲线的测定
• 4.3.2 重组菌发酵条件的优化
• 4.3.3 酶活测定
• 4.4 实验结果与分析
• 4.4.1 碳源对重组毕赤酵母发酵生产RML 的影响
• 4.4.2 氮源对重组毕赤酵母发酵生产RML 的影响
• 4.4.3 诱导温度对毕赤酵母发酵表达RML 的影响
• 4.4.4 甲醇浓度对重组毕赤酵母发酵表达RML 的影响
• 4.5
• 4.5.1 小结
• 4.5.2 讨论
• 第五章 米黑根毛霉脂肪酶酶学性质的初步研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料与仪器
• 5.2.1 实验菌株
• 5.2.2 主要生化试剂
• 5.2.3 主要实验仪器
• 5.2.4 主要溶液
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 脂肪酶的酶活测定方法——对硝基苯酚比色法（p-NP 法）
• 5.3.1.1 对硝基苯酚标准曲线的制备
• 5.3.1.2 脂肪酶活力的测定
• 5.3.2 酶学性质研究
• 5.3.2.1 酶作用最适pH
• 5.3.2.2 酶的pH 稳定性
• 5.3.2.3 酶作用最适温度
• 5.3.2.4 酶的热稳定性
• 5.3.2.5 金属离子对酶活性的影响
• 5.3.2.6 酶的底物特异性
• 5.4 实验结果与分析
• 5.4.1 对硝基苯酚标准曲线的绘制
• 5.4.2 RML 粗酶的酶学性质
• 5.4.2.1 RML 的最适pH 值和pH 值稳定性
• 5.4.2.2 RML 的最适温度和热稳定性
• 5.4.2.3 金属离子对酶活的影响
• 5.4.2.4 RML 的底物特异性
• 5.5 小结与讨论
• 5.5.1 小结
• 5.5.2 讨论
• 结论与展望
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 攻读博士/硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附录 重组质粒 pPIC9K-RML 的 RML 测序结果
• 答辩委员会对论文的评定意见