马流感病毒检测方法的建立

论文摘要

马流感（Equine influenza,EI）是由马流感病毒引起马的一种急性高度接触传染性、群发性呼吸道疾病,类似于人流感,典型的临床症状为突发高热、咳嗽、呼吸困难、食欲减退。马流感病毒（Equine influenza virus,EIV）属正粘病毒科A型流感病毒,有H7N7和H3N8两个亚型。前者于1979年最后一次在意大利流行后再未分离到,然而,H3N8每年都有发生。目前,马流感没有有效的治疗措施,因此,建立有效的检测方法来监控马流感是非常重要的。1.马流感病毒间接免疫荧光检测方法的建立马流感病毒接种鸡胚,收获的尿囊液经差速离心后,再经蔗糖超速离心,提纯EIV。提纯后的EIV经灭活并与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混和后免疫新西兰兔三次,制备了多克隆抗体,建立了间接免疫荧光试验。其最适工作条件为:80%丙酮4℃固定30 min;一抗最佳浓度为1:80,37℃作用60 min;二抗最佳浓度为1:40,37℃作用60min。本方法可用于EI的检测。2.马流感病毒RT-PCR检测方法的建立从GenBank上调取马H3N8流感病毒HA和NA的基因序列,经过分析,设计并合成两套RT-PcR引物,分别对马流感病毒尿囊液进行扩增,结果能扩增出与目的片断大小一致的条带,胶回收PCR产物进行序列测定,证实为EIV HA和NA的基因。从而建立了RT-PCR检测方法,经各反应条件优化后,发现两套RT-PCR引物均能扩增10 TCID50的尿囊液病毒,对AIV（H5、H7、H9）、H3N1、H3N2、Pi等6种病毒核酸进行扩增,均未扩增出特异性条带,表明它具有良好的特异性,上述结果显示,本文建立的RT-PCR检测方法具有高效、快速、特异、灵敏的特点,可用于EIV的检测和监控。3.马流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立从GenBank上调取马H3N8流感病毒的基因序列,针对NA基因相对保守区域的核苷酸序列,用DNAStar和Primer Expression 3.0软件设计1对引物和TaqMan探针,以马流感病毒的cDNA为模板,建立了马流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法,经反应条件优化后,对AIV（H5、H7、H9）、H3N1、H3N2、Pi等6种病毒核酸进行扩增,发现具有良好的特异性;对10倍倍比稀释的RNA、cDNA和目的片段的双链DNA进行扩增检测其灵敏度,发现建立的荧光RT-PCR分别能检测0.1 TCID50和20个拷贝的双链DNA,结果显示该方法具有高效、快速、特异、灵敏的特点,可用于马流感病毒的检测和监控。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语中的中英文对照
• 第一篇 文献综述
• 第一章 马流感病毒的研究进展
• 1 病原学
• 2 流行病学
• 3 临床表现、病理变化及发病机制
• 4 诊断技术
• 5 马流感的监测及预防控制
• 6 疫苗
• 7 结束语
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第二章 马流感病毒间接免疫荧光检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 英文摘要
• 第三章 马流感病毒RT-PCR检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 英文摘要
• 第四章 马流感病毒Real time RT-PCR检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 英文摘要
• 全文总结
• 硕士期间发表的论文
• 致谢
• 附件