南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶cDNA原核表达载体构建

论文摘要

β-胡萝卜素羟化酶（β-cryptoxylase）是一种非血红素双铁单加氧酶,催化植物中的β-胡萝卜素（β-carotene）经过中间产物β-隐黄素形成玉米黄素（zeaxanthin）。它广泛存在于植物、海生细菌、蓝藻等生物中。不同生物的β-胡萝卜素羟化酶基因（CHX）序列具有一定的保守性,特别是在高等植物和绿藻间该酶的保守性更高。多种生物的β-胡萝卜素羟化酶基因已被克隆并分别在细菌、蓝藻或植物中表达。本研究旨在克隆编码南丰蜜橘（Citrus reticulata Blanco var.kinokuni（Tanaka）H.H.Hu）β-胡萝卜素羟化酶的cDNA,并构建原核表达载体,包括以下部分:1提取幼嫩叶片的基因组DNA和总RNA。2设计一对带酶切位点的特异性引物进行RT-PCR（reversetranscription-polymerase chain reaction）,回收纯化目的片段,克隆到pMD19-TSimple载体上,重组质粒pMD19-T-CHX被转化到大肠杆菌DH5α中培养,挑单菌落进行菌落PCR,筛选阳性克隆子提取质粒进行酶切鉴定并送检测序,测序结果与GenBank中已有的南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶基因序列预测的cDNA进行比较,确认目的基因克隆正确。3对重组质粒进行双酶切,回收纯化目的片段后连接到原核表达载体pET-20b（+）上,重组质粒PET-CHX转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,进行抗性筛选、菌落PCR、酶切和测序鉴定,确认原核表达载体构建成功。4对β-胡萝卜素羟化酶的蛋白结构进行生物信息学分析。本实验成功克隆了编码南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶的cDNA并构建了原核表达载体。生物信息学分析表明表明β-胡萝卜素羟化酶含311个氨基酸分子量为34.7854 kDa,pI值为9.03。该酶定位于类囊体膜上,TMpred跨膜分析显示它含有四个显著的跨膜螺旋区,这些区域与ProtScale预测的疏水区基本重叠。该酶二级结构以α-螺旋为主,且含多种磷酸化位点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 前言
• 1.1 引言
• 1.2 类胡萝卜素
• 1.2.1 类胡萝卜素的结构特点
• 1.2.2 类胡萝卜素的功能
• 1.3 β-胡萝卜素羟化酶基因
• 1.4 β-胡萝卜素羟化酶
• 1.5 β-胡萝卜素羟化酶在类胡萝卜素代谢途径中的位置
• 1.6 β-胡萝卜素羟化酶的作用机理
• 1.7 β-胡萝卜素羟化酶催化的产物
• 1.7.1 β-隐黄素
• 1.7.2 玉米黄素
• 1.8 β-羟化酶的克隆表达研究现状
• 1.9 大肠杆菌表达载体
• 1.10 本论文的研究目的与意义
• 第2章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 使用的数据库及分析软件
• 2.1.4 主要仪器和耗材
• 2.1.5 主要试剂
• 2.1.6 常用缓冲液与溶液及配制
• 2.1.7 电泳胶
• 2.1.8 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 核酸的提取和纯化
• 2.2.2 β-胡萝卜素羟化酶cDNA的克隆与鉴定
• 2.2.3 原核表达载体的构建
• 第3章 结果与分析
• 3.1 核酸的提取和纯化
• 3.1.1 基因组DNA提取结果
• 3.1.2 RNA的提取结果
• 3.2 β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与鉴定
• 3.2.1 RT-PCR
• 3.2.2 菌落PCR
• 3.2.3 重组质粒pMD19-T-CHX的提取
• 3.2.4 测序结果及序列分析
• 3.3 原核表达载的构建
• 3.3.1 pMD19-T-CHX和PET载体的双酶切
• 3.3.2 菌落PCR
• 3.3.3 PET-CHX质粒的提取
• 3.3.4 PET-CHX的双酶切
• 3.3.5 测序
• 3.4 南丰密橘β-胡萝卜素羟化酶蛋白结构的生物信息学分析
• 3.4.1 南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶的理化性质分析
• 3.4.2 南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶模体的分析
• 3.4.3 南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶蛋白质跨膜性分析
• 3.4.4 南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶蛋白质疏水性分析
• 3.4.5 南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶蛋白质二、三级结构分析
• 3.4.6 南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶蛋白质序列比对分析
• 第4章 讨论
• 4.1 RNA的提取
• 4.2 PCR体系的优化
• 4.3 真核基因在大肠杆菌中的表达
• 4.4 β-胡萝卜素羟化酶表达的调控机制
• 4.5 β-胡萝卜素羟化酶在类胡萝卜素生产中的利用前景
• 致谢
• 参考文献
• 附录A Cit pMD19-T-CHX P47测序波形图
• 附录B 0516786（2）G01测序波形图
• 附录C 缩略词
• 攻读学位期间的研究成果