绿僵菌MA4菌株对椰心叶甲的防效及其表皮降解蛋白酶基因Pr1A的克隆表达和抗血清研究

论文摘要

外来入侵生物椰心叶甲（Brontispa longissima （Gestro））是亚太地区棕榈科植物的毁灭性害虫,近年传入我国海南省等地后对当地的椰子、槟榔等棕榈科植物的生长造成严重危害,并导致重大经济和生态损失。本文通过室内毒力测定的方法,筛选出一株对椰心叶甲具有高毒力的绿僵菌菌株MA4,对其做了ITS鉴定,并对其表皮降解蛋白酶基因Pr1A进行了克隆表达和抗血清研究,同时就筛选到的高毒力和低毒力菌株研究了在不同培养基上它们的蛋白酶产量与毒力间的关系。主要结果如下:（1）采用土壤分离法和僵虫分离法,获得21株不同来源的绿僵菌。通过对这21株绿僵菌采用2级筛选法进行室内毒力测定,最终确定MA4菌株对椰心叶甲的毒力相对是最高的,为防治椰心叶甲的优势种。（2）对MA4菌株的ITS进行了克隆和测序,并将之与GenBank已登录的ITS序列进行比较,发现与金龟子绿僵菌小孢变种（Metarhizium anisopliae var. anisopliae）有很高的同源性,达到94.2%,且测出全长为524bp,说明MA4菌株很有可能为金龟子绿僵菌小孢变种。（3）用明胶和椰心叶甲虫尸粉两种液体培养基对高毒力菌株MA4和弱毒力菌株MA12的蛋白酶产酶水平进行分析。两菌株在虫尸粉液体培养基中蛋白酶的产量明显高于明胶液体培养基,且MA4菌株的产酶量高于MA12菌株。此外,用明胶-琼脂平板法对MA4和MA12两株菌株的蛋白酶产量进行了测定,两菌株的最适产蛋白酶的温度都在28℃。不管用明胶-琼脂平板法还是虫尸粉液体培养基,所测得的蛋白酶的产量水平均与其对椰心叶甲的毒力之间存在相对应的关系。（4）Pr1A基因的基因产物Pr1A蛋白具有很强的分解昆虫体壁的功能,在对昆虫的致病力中起着重要的作用。采用RT-PCR的方法,从MA4扩增得到Pr1A基因全长,此基因全长为1242bp,经Blastn分析此基因序列与M. anisopliae的Pr1A基因（M73795）同源率为98%。以pET-22b（+）为基础载体,构建pET-Pr1A重组表达载体,在大肠杆菌（Escherichia. coli ）BL 21（DE3）中进行表达。经SDS-PAGE分析,获得了约42kDa大小的重组目的蛋白,表达的目的蛋白最高可占表达总蛋白含量的63.2%。（5）将表达的Pr1A重组蛋白切胶回收,研磨成粉后加入等体积的福氏不完全佐剂,乳化制备成抗原,免疫家兔四次后,采血收集抗血清。该抗血清的ELISA效价为1/1000,并且Western-blotting分析表明Pr1A重组蛋白能与抗血清发生良好的免疫反应,说明获得了Pr1A重组蛋白的抗体。（6）用所获得的Pr1A重组蛋白的抗体进行了免疫斑点杂交实验,检测了上述实验的MA4菌株培养了2d的明胶和虫尸粉液体培养基的蛋白酶液中Pr1A蛋白的表达情况,两者均呈阳性反应,但显色深浅程度有所不同。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要（abstract）
• 1 前言
• 1.1 虫生真菌的研究历程
• 1.2 我国虫生真菌资源及利用
• 1.3 椰心叶甲的发生与危害
• 1.4 椰心叶甲的防治现状
• 1.4.1 物理防治
• 1.4.2 化学防治
• 1.4.3 生物防治
• 1.5 绿僵菌
• 1.5.1 绿僵菌对害虫的控制
• 1.5.2 利用绿僵菌对害虫的控制
• 1.5.3 绿僵菌的毒力研究
• 1.5.4 绿僵菌对昆虫的侵染机理
• 1.5.5 绿僵菌入侵过程中相关基因的研究
• 1.6 目前国内外对绿僵菌的研究技术发展趋势
• 1.7 本论文的研究意义及主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 绿僵菌菌株的分离及鉴定
• 2.1.1 椰心叶甲僵虫的采集
• 2.1.2 土样的采集
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 菌株的分离与纯化
• 2.1.5 菌株的鉴定
• 2.2 绿僵菌菌株对椰心叶甲致病力的室内毒力测定
• 2.2.1 菌株来源
• 2.2.2 供试昆虫
• 2.2.3 测定方法
• 2.2.3.1 初步的室内毒力测定方法
• 2.2.3.2 高毒力菌株的进一步筛选
• 2.3 MA4 菌株的 ITS 序列测定
• 2.3.1 材料与试剂
• 2.3.2 方法
• 2.3.2.1 基因组DNA 提取
• 2.3.2.2 ITS 的 PCR 扩增
• 2.3.2.3 PCR 产物的回收
• 2.3.2.4 回收产物的连接
• 2.3.2.5 大肠杆菌E.coli JM109 感受态细胞的制备
• 2.3.2.6 连接产物转化至大肠杆菌E.coli JM109 感受态细胞
• 2.3.2.7 克隆载体质粒DNA 的提取
• 2.3.2.8 重组质粒PCR 检测鉴定
• 2.4 绿僵菌的蛋白酶活性及其与毒力间的关系
• 2.4.1 供试菌株
• 2.4.2 试剂
• 2.4.3 明胶、虫尸粉培养基的制备及蛋白酶活性的测定
• 2.4.3.1 孢子液的制备
• 2.4.3.2 虫尸粉培养基的制备
• 2.4.3.3 明胶液体培养基的制备
• 2.4.3.4 蛋白酶活性的测定
• 2.4.4 明胶-琼脂平板分析法
• 2.5 MA4 菌株的表皮降解蛋白酶基因 Pr1A 的克隆及表达
• 2.5.1 材料及试剂
• 2.5.2 方法
• 2.5.2.1 引物的设计
• 2.5.2.2 MA4 菌株总 RNA 的提取
• 2.5.2.3 cDNA 的合成
• 2.5.2.4 PCR 扩增
• 2.5.2.5 回收片段的克隆
• 2.5.2.6 Pr1A 基因的表达
• 2.5.2.7 表达产物的SDS-PAGE 电泳
• 2.6 Pr1A 重组蛋白的抗血清研究
• 2.6.1 抗原的制备
• 2.6.2 免疫程序
• 2.6.3 血液处理及保存
• 2.6.4 抗血清的ELISA 效价
• 2.6.5 Pr1A 重组蛋白的 Western-blotting 分析
• 2.6.6 蛋白酶液的免疫斑点杂交检测
• 3 结果与分析
• 3.1 绿僵菌菌株的分离及鉴定
• 3.1.1 菌株的培养特征
• 3.1.2 分生孢子的形状及大小
• 3.2 绿僵菌菌株对椰心叶甲致病力的室内毒力测定
• 3.2.1 发病症状
• 3.2.2 初步的室内毒力测定结果
• 3.2.3 高毒力菌株进一步筛选的结果
• 3.3 MA4 菌株的 ITS 序列测定
• 3.3.1 MA4 菌株基因组 DNA 的提取
• 3.3.2 ITS 的 PCR 扩增结果
• 3.3.3 重组质粒的PCR 鉴定
• 3.3.4 ITS 序列结果分析
• 3.4 绿僵菌的蛋白酶活性及其与毒力间的关系
• 3.4.1 两株绿僵菌菌株的产酶水平结果与分析
• 3.4.2 两株绿僵菌菌株蛋白酶产量的测定
• 3.5 MA4 菌株的表皮降解蛋白酶基因 Pr1A 的克隆与表达
• 3.5.1 Pr1A 基因克隆与鉴定
• 3.5.2 表达载体的构建及酶切鉴定
• 3.5.3 Pr1A 基因的序列分析
• 3.5.4 Pr1A 基因在大肠杆菌中的表达分析
• 3.6 Pr1A 重组蛋白的抗血清研究
• 3.6.1 抗血清制备
• 3.6.2 抗血清的ELISA 效价
• 3.6.3 Pr1A 重组蛋白的 Western-blotting 分析
• 3.6.4 蛋白酶液的免疫斑点杂交检测
• 4 讨论
• 4.1 绿僵菌高毒力菌株的筛选
• 4.2 MA4 菌株的 ITS 序列的测定
• 4.3 绿僵菌的蛋白酶活性及其与毒力间的关系
• 4.4 MA4 菌株的表皮降解蛋白酶基因 Pr1A 的克隆与表达
• 4.5 Pr1A 重组蛋白的抗血清研究
• 5 结论
• 参考文献
• 附录 就读期间公开发表的论文
• 致谢