荧光纳米标记与水凝胶技术用于大肠杆菌O157：H7的检测研究

论文摘要

食物安全、环境监测、疾病诊断以及反细菌战等领域都涉及到对病原菌的检测。大肠杆菌O157:H7作为一类严重威胁公共健康的病原菌,已经得到了食品安全、疾病诊断、环境监测等多个领域的高度重视。它主要通过受污染的食物（饮用水、肉制品和原料奶等）向人类传播,从而引发多种疾病,如出血性肠炎、腹泻等,严重时可导致死亡,给人类的健康带来极大的困扰。在对大肠杆菌O157:H7的管理与控制中,快速而准确的诊断至关重要。因此,本论文瞄准大肠杆菌O157:H7快速、灵敏检测这一重要性,在对各种病原菌检测方法进行简要综述的基础上,开展了基于荧光纳米标记与水凝胶技术用于大肠杆菌O157:H7的快速、灵敏检测研究,主要包括以下几个方面的工作:一、基于二氧化硅荧光纳米颗粒与核酸染料SYBR GreenⅠ的双色显微成像技术用于大肠杆菌O157:H7的检测研究将荧光纳米标记技术与激光共聚焦显微成像法相结合,发展了一种新型的基于二氧化硅荧光纳米颗粒与核酸染料SYBR GreenⅠ的双色显微成像技术用于大肠杆菌O157:H7的检测。利用联吡啶钌（RuBpy）二氧化硅荧光纳米颗粒对羊抗大肠杆菌O157:H7抗体进行标记,基于抗体-抗原相互作用的原理实现功能化二氧化硅荧光纳米颗粒对目标大肠杆菌O157:H7的特异性捕获,同时以核酸染料SYBR GreenⅠ对细菌核酸进行染色,将细菌和体系中的纳米颗粒团聚体区分开来,从而实现了对大肠杆菌O157:H7的双色标记,并通过激光共聚焦显微镜进行免分离的荧光成像检测。结果表明,该方法可成功应用于缓冲液体系和混合细菌样品中目标大肠杆菌O157:H7的特异性检测,特别是在仅含5%目标菌的混合样品中仍能观察到具有明显黄色荧光的大肠杆菌O157:H7,且整个检测步骤包括样品预处理可在3h内完成。该方法则具有较好的灵敏度,可检出2.6×103cells/mL的目标细菌样品,若采用针对其他病原菌细胞壁抗原的特异性抗体,该方法有潜力发展成为一种通用技术用于多种病原菌的快速和较准确检测。二、基于磁纳米颗粒富集结合二氧化硅荧光纳米颗粒标记的双色流式细胞术用于大肠杆菌O157:H7的检测研究将磁纳米颗粒富集技术、基于二氧化硅荧光纳米颗粒的免疫荧光分析法与流式细胞术相结合,发展了一种新型的基于磁纳米颗粒富集结合联吡啶钌（RuBpy）二氧化硅荧光纳米颗粒标记的双色流式细胞术用于大肠杆菌O157:H7的检测。首先利用表面修饰甘露糖的磁纳米颗粒将待测样品中的目标菌在外加磁场的作用下富集起来,再采用RuBpy二氧化硅荧光纳米颗粒标记的抗体对样品中目标大肠杆菌O157:H7进行免疫荧光标记后,以核酸染料SYBR GreenⅠ对样品中细菌的核酸进行染色,从而将细菌与样品中的碎片杂质区分开来,最后通过多参数流式细胞术对样品中双色标记的大肠杆菌O157:H7进行检测与分析,并将该方法用于对缓冲液体系和实际样品——矿泉水中的大肠杆菌O157:H7进行检测。结果表明,通过磁纳米颗粒富集作用、二氧化硅荧光纳米颗粒的信号放大作用及核酸染色,显著地提高了检测灵敏度,减小了由纳米颗粒团聚以及纳米颗粒对杂质碎片的非特异性吸附所引起的假阳性信号,对缓冲液体系和实际样品的检测下限分别为7和6cells/mL大肠杆菌O157:H7,并且比基于FITC标记的传统流式细胞术具有更高的灵敏度,整个检测步骤包括样品预处理可在4h内完成,该法有望发展成为一种通用的方法用于食品检验、医学诊断和环境保护等领域中各种病原菌的快速检测。三、基于甘露糖功能化的水凝胶用于大肠杆菌O157:H7的检测研究利用伴刀豆球蛋白（Con A）多价结合能力,结合水凝胶技术与核酸染色技术发展了一种基于甘露糖功能化水凝胶的大肠杆菌O157:H7检测方法。首先以过硫酸铵（APS）为催化剂,四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂,将丙烯酰胺（AAm）、N,N-二甲基双丙烯酰胺和N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺（NAS）合成水凝胶,然后将氨基化甘露糖交联到NAS上,从而制备了功能化的水凝胶。将上述合成的水凝胶与样品共孵育1h后,以SYBR GreenⅠ对细菌的核酸进行染色,最后利用活体荧光成像系统对目标大肠杆菌O157:H7进行荧光成像。结果表明,该方法可成功应用于缓冲液体系和混合细菌样品中目标大肠杆菌O157:H7的特异性检测,整个实验过程包括样品预处理可在2h内完成。该方法具有较好的灵敏度,可检出3.7×101cells/mL的目标细菌样品,从而实现对病原菌快速、低成本、易操作和较高灵敏检测和分析。

论文目录

摘要

ABSTRACT

本文所用英文缩写词表

第1章绪论

1.1 引言

1.2 传统的病原菌检测方法

1.2.1 平板菌落计数法（plate count）

1.2.2 多管发酵法（multiple tube fermentation，MTF）

1.2.3 滤膜法（membrane fiIter，MF）

1.3 新型的病原菌快速检测方法

1.3.1 分子生物学方法

1.3.2 酶联免疫吸附法

1.3.3 生物传感器用于病原菌的检测

1.3.4 流式细胞术用于病原菌的检测

1.3.5 功能化纳米材料用于病原菌的检测

1.4 本论文构思

第2章基于二氧化硅荧光纳米颗粒与核酸染料SYBR GREEN Ⅰ 的双色显微成像技术用于大肠杆菌O157:H7 的检测研究

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂和仪器

2.2.2 大肠杆菌O157:H7 与大肠杆菌DH5α的培养

2.2.3 RuBpy 二氧化硅荧光纳米颗粒的制备、生物修饰及表征

2.2.4 双色显微成像技术用于大肠杆菌O157:H7 的检测

2.2.5 混合细菌样品的制备和检测

2.3 结果与讨论

2.3.1 RuBpy 二氧化硅荧光纳米颗粒的表征

2.3.2 基于二氧化硅荧光纳米颗粒与SYBR Green Ⅰ 的双色显微成像技术对大肠杆菌O157:H7 的检测原理

2.3.3 基于二氧化硅荧光纳米颗粒与SYBR Green Ⅰ 的双色显微成像技术对大肠杆菌O157:H7 的检测

2.3.4 基于二氧化硅荧光纳米颗粒与SYBR Green Ⅰ 的双色显微成像技术对混合细菌样品中大肠杆菌O157:H7 的特异性检测

2.4 小结

第3章基于磁纳米颗粒富集结合二氧化硅荧光纳米颗粒标记的双色流式细胞术用于大肠杆菌O157:H7 的检测研究

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂和仪器

3.2.2 RuBpy 二氧化硅荧光纳米颗粒的制备、定量及表征

3.2.3 RuBpy 二氧化硅荧光纳米颗粒表面羊抗大肠杆菌O157:H7 抗体的修饰

3.2.4 羧基化甘露糖的制备及磁纳米颗粒表面羧基化甘露糖的修饰

3.2.5 大肠杆菌O157:H7 的培养与计数

3.2.6 大肠杆菌O157:H7 标准样品的制备

3.2.7 基于磁纳米颗粒富集结合二氧化硅荧光纳米颗粒标记的双色流式细胞术用于大肠杆菌O157:H7 的检测

3.2.8 激光共聚焦显微成像法对大肠杆菌 O157:H7 的检测

3.2.9 FITC 标记的传统流式细胞术对大肠杆菌O157:H7 的检测

3.2.10 掺杂矿泉水样品的制备

3.2.11 流式细胞术分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 RuBpy 二氧化硅荧光纳米颗粒的定量与表征

3.3.2 功能化二氧化硅荧光纳米颗粒和功能化磁纳米颗粒的表征

3.3.3 大肠杆菌O157:H7 的计数

3.3.4 基于磁纳米颗粒富集结合二氧化硅荧光纳米颗粒标记的双色流式细胞术检测大肠杆菌O157:H7 的原理

3.3.5 基于磁纳米颗粒富集结合二氧化硅荧光纳米颗粒标记的双色流式细胞术检测大肠杆菌O157:H7 的可行性研究

3.3.6 基于磁纳米颗粒富集结合二氧化硅荧光纳米颗粒标记的双色流式细胞术对大肠杆菌O157:H7 检测的灵敏度

3.3.7 激光共聚焦显微成像法对大肠杆菌 O157:H7 的检测

3.3.8 FITC 标记的传统流式细胞术对大肠杆菌O157:H7 的检测

3.3.9 基于磁纳米颗粒富集结合二氧化硅荧光纳米颗粒标记的双色流式细胞术对掺杂矿泉水中大肠杆菌O157:H7 的检测

3.4 小结

第4章基于甘露糖功能化的水凝胶用于大肠杆菌O157:H7 的检测研究

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂和仪器

4.2.2 不同浓度水凝胶的制备

4.2.3 考察不同浓度的水凝胶与阿霉素的交联及荧光强度

4.2.4 考察NAS 的量

4.2.5 细菌的培养与计数

4.2.6 水凝胶与氨基化甘露糖的交联

4.2.7 基于甘露糖功能化的水凝胶用于大肠杆菌O157:H7 的检测

4.2.8 基于甘露糖功能化的水凝胶用于混合样品中大肠杆菌 O157:H7 的检测

4.3 结果与讨论

4.3.1 不同浓度的水凝胶与阿霉素交联后的荧光强度

4.3.2 考察NAS 的量

4.3.3 细菌计数

4.3.4 基于甘露糖功能化的水凝胶用于大肠杆菌O157:H7 的检测原理

4.3.5 基于甘露糖功能化的水凝胶用于大肠杆菌O157:H7 的可行性考察

4.3.6 基于甘露糖功能化的水凝胶用于大肠杆菌O157:H7 检测的灵敏度

4.3.7 基于甘露糖功能化的水凝胶用于大肠杆菌 O157:H7 检测的特异性考察

4.4 小结

结论

参考文献

附录攻读硕士学位期间所发表的学术论文及专利目录

致谢

荧光纳米标记与水凝胶技术用于大肠杆菌O157：H7的检测研究

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