牛8个基因的克隆、表达特征、原核表达、SNPs检测及其与部分性状的关联分析

论文摘要

牛育种工作的最终目的是提高牛生产的经济效益。因此,在确定育种目标时,应该充分考虑长久影响牛群经济效益的所有性状。出于这点考虑,在牛育种中不仅要考虑直接作用牛生产经济效益的主生产性状,而且要考虑诸如繁殖力、使用年限、产犊行为、抗病力等间接作用牛生产经济效益的所谓次级性状。但次级性状本身受到环境、遗传以及营养条件等多种因素的影响,难于度量,且其遗传力较低,所以利用常规育种的方法选择次级性状的准确性低,遗传进展慢。为揭示次级性状的遗传规律提供方法论,本研究采用现代分子数量联合育种方法,针对影响牛只健康和生产效率性状中与使用年限关联的一些基因,应用EST拼接、RT-PCR、GenScan、直接测序、RFLP、荧光定量PCR、原核表达等技术以及生物信息学和关联分析方法,进行了基础的分子遗传学探索,获得如下结果:1.得到了牛AKAP10、MBL2、PON1、P53、PON2、SIRT2、SIRT3和WARS2共8个候选基因完整的CDS区序列并进行了生物信息学分析。向GenBank数据库提交了AKAP10、PON1、PON2和SIRT2等4个基因的cDNA序列,获取的登录号分别为:EU239246、EU289337、EF522785和EU562194。2.对所研究候选基因中的AKAP10、PON1、PON2、MBL2和WARS2等5个基因在卵巢、肝脏、肌肉、小肠、脂肪、子宫、肾脏、心脏、肺、淋巴、瘤胃、睾丸和乳腺共13个组织中的表达进行了表达特性研究,结果表明,除AKAP10基因是在睾丸中表达量最高外,其它4个基因均表现为肝脏中表达量最高。与NCBI数据库中的电子表达谱比较分析表明,两者之间有着很明显的差异。3.对牛的PON1和PON2两个新基因外显子进行SNPs的检测,发现在PON1基因第6外显子A147G和G162A;PON2基因第5外显子A73G和A110G、第6外显子T76C、第9外显子T98C共6个SNPs,并对其中的PON1基因的第6外显子A147G和G162A3,以及PON2基因的第9外显子T98C共3个位点进行了PCR-RFLP和PCR-SSCP多态性遗传特性分析。分析了它们在12个牛群体中的基因型频率,及等位基因的分布差异。4.对PON1和PON2基因的多态基因型与体尺体重及部分生长和胴体性状进行了关联分析,结果发现:（1）鲁西牛6种体尺体重性状间除体高与其它性状之间相关性不显著外,体重、体长、胸围、管围和腹围之间都表现出显著的相关（P<0.05）;（2）PON1基因第6外显子多态性中,AA基因型个体可能为短期肥育类型;GG型个体则应在选择过程中加以淘汰;GA型个体有可能具有比较合理的体型结构和生长发育模式,A162G位点可尝试用于家畜生产年限的预测;（3）PON1基因双酶切位点分析表明,专门化的肉用品种比兼用牛品种有着更为明显的生长特性。胴体性状方面,西门塔尔牛除背膘厚、嫩度、总骨重、眼肌面积和肉色性状外,其它性状存在相对劣势。同时,牛实验期初始重的差异对于某种单体型个体可能源自潜在的生长势,并表明PON1基因的AeAeGaGa基因型可能直接影响牛的背膘厚（P<0.01）;（4）在与7个品种关联分析中,PON1基因EcoRⅤ-RFLP位点BB基因型个体的眼肌面积显著高于AA和AB基因型（P=0.0302）;（5）PON2基因第9外显子三种基因型频率在7个牛品种间存在极显著的差异（P < 0.01）,而各品种中各种基因型间与各品种间差异不显著（P > 0.05）,在鲁西牛不同年龄组间无显著差异（P > 0.05）。而三种基因型频率之间则存在极显著的差异（P < 0.01）,且三种基因型频率均有随着年龄增加而降低的趋势,但AA型和BB型个体在一定的年龄之后,（约为7岁）又均有数量增加的现象。5.构建了牛PON1和PON2基因的pET28a+原核表达载体,并成功地在BL21表达菌种中实现了对氧磷酶1（PON1）和对氧磷酶2（PON2）两种蛋白的融合表达,为进一步纯化和应用提供依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 牛基因组计划
• 1.2 表达序列标签（EST）在基因克隆中的应用
• 1.3 候选基因法（CANDIDATE GENE APPROACH）克隆基因
• 1.4 实时荧光定量PCR 技术在基因组织表达中的应用
• 1.5 原核表达载体在基因表达中的应用
• 1.6 常用的两种SNP 检测方法
• 1.6.1 单链构象多态性（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）
• 1.6.2 限制性片段长度多态性分析（restriction fregmant length polymorphism, RFLP）
• 1.7 寿命基因相关研究历史和现状
• 1.7.1 模式生物研究进展
• 1.7.2 人类寿命研究
• 1.7.3 其它因素与寿命
• 1.8 拟研究与牛的寿命相关基因的研究现状
• 1.8.1 蛋白激酶A 绑定蛋白10 基因（Protein kinase A anchoring protein 10 gene, AKAP10）
• 1.8.2 甘露糖结合蛋白2 基因（mannose-binding lectin 2,MBL2）
• 1.8.3 p53 抑癌基因（p53 oncogene）
• 1.8.4 对氧磷酶基因（Paraoxonase-Gene, PONs）
• 1.8.5 Si12 样基因沉默因子基因2, 3 （Sirtuin-like gene 2 to 3, SIRT2, SIRT3）
• 1.8.6 色氨酰-tRNA 合成酶2 基因（Sryptophanyl-trna synthetase, WAR52）
• 1.9 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 血样样品
• 2.1.2 组织样品
• 2.1.3 培养基、酶及试剂盒
• 2.1.4 菌株和载体
• 2.1.5 主要试剂及配制
• 2.1.5.1 主要试剂
• 2.1.5.2 其它试剂的配制
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.1.7 主要分子生物学数据库及软件
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 候选基因cDNA 的克隆
• 2.2.1.1 用于候选基因cDNA 克隆的引物及设计思路
• 2.2.1.2 总RNA 提取
• 2.2.1.3 总RNA 的甲醛凝胶电泳
• 2.2.1.4 cDNA 第一链的合成
• 2.2.1.5 RT-PCR 扩增反应体系及扩增条件
• 2.2.1.6 产物的纯化、克隆，鉴定和测序
• 2.2.1.7 DNA 序列同源性检索鉴定
• 2.2.2 牛PON1 和PON2 基因的SNPs 寻找
• 2.2.2.1 牛基因组DNA 的提取
• 2.2.2.2 用于SNPs 寻找的引物及设计思路
• 2.2.2.3 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.2.4 扩增产物的酶切分析
• 2.2.3 候选基因的组织表达分析
• 2.2.3.1 用于组织表达的引物及设计思路
• 2.2.3.2 RT-PCR 反应体系及扩增条件
• 2.2.3.3 基因表达量的计算
• 2.2.4 PON1 和PON2 基因的原核表达
• 2.2.4.1 获得目的基因
• 2.2.4.2 构建重组表达载体
• 2.2.5 数据统计分析
• 2.2.5.1 基因频率和基因型频率的计算
• 2.2.5.2 多态信息含量（PIC）
• 2.2.5.3 有效等位基因数（Ne）
• 2.2.5.4 群体杂合度（He）
• 2.2.5.5 Hardy-Weinberg 平衡检测
• 2.2.5.6 统计分析模型
• 第三章 结果与分析
• 3.1 候选基因CDNA 的克隆、鉴定及生物信息学分析
• 3.1.1 总RNA 和基因组DNA 的提取与检测
• 3.1.2 牛AKAP10 基因cDNA 克隆及生物信息学分析
• 3.1.3 牛MBL2 基因cDNA 克隆及生物信息学分析
• 3.1.4 牛PON1 基因cDNA 克隆及生物信息学分析
• 3.1.5 牛PON2 基因cDNA 克隆及生物信息学分析
• 3.1.6 牛p53 基因cDNA 克隆及生物信息学分析
• 3.1.7 牛SIRT2 基因cDNA 克隆及生物信息学分析
• 3.1.8 牛SIRT3 基因cDNA 克隆及生物信息学分析
• 3.1.9 牛WARS2 基因cDNA 克隆及生物信息学分析
• 3.2 牛PON1 和PON2 基因的SNPS 检测及关联分析
• 3.2.1 PON1 基因的遗传变异检测
• 3.2.1.1 PCR 产物分型分析
• 3.2.1.2 该基因两个突变位点在不同品种中的遗传学基础分析
• 3.2.2 PON1 基因多态性与生长和胴体性状关联分析
• 3.2.2.1 AluⅠ酶切多态性与鲁西牛不同年龄体尺的相关及生产年限的预测
• 3.2.2.2 3 个品种中PON1 基因多态性与生长和胴体性状关联分析
• 3.2.2.3 7 个品种中PON1 基因多态性与生长和胴体性状关联分析
• 3.2.3 PON2 基因的遗传变异检测
• 3.2.3.1 PON2 基因外显子SNPs 扫描及SSCP 分析
• 3.2.3.2 PON2 基因外显子9 遗传多态性各指标分析
• 3.2.3.3 PON2 基因多态性与不同牛品种品种间和鲁西牛年龄间的差异分析
• 3.3 部分候选基因组织表达研究
• 3.3.1 用于组织表达研究的cDNA 第一链的质量检测
• 3.3.2 牛AKAP10 基因的组织表达特征
• 3.3.3 牛PON1 基因的组织表达特征
• 3.3.4 牛PON2 基因的组织表达特征
• 3.3.5 牛MBL2 基因的组织表达谱分析
• 3.3.6 牛WAR52 基因的组织表达谱分析
• 3.4 PON1 和PON2 基因原核表达载体构建和诱导表达
• 3.4.1 PON1 和PON2 基因编码区克隆
• 3.4.2 pET28a+ PON1 和pET28a+ PON2 基因表达载体的构建和鉴定
• 3.4.3 目的蛋白的诱导表达与鉴定
• 第四章 讨论
• 4.1 关于总RNA 和DNA 提取的质量
• 4.2 关于基因的分离
• 4.3 关于基因的生物信息学分析
• 4.3.1 生物信息学在核酸序列分析中的应用
• 4.3.2 生物信息学在蛋白序列分析中的应用
• 4.4 关于SNPS 检测
• 4.4.1 利用生物信息学预测SNPs
• 4.4.2 直接测序获得新的SNPs
• 4.4.3 利用创造酶切位点法分析基因突变
• 4.5 关于基因多态性与性状的关联分析
• 4.5.1 关于统计分析模型的构建
• 4.5.2 关于PON1/EcoRⅤ位点多态性及相关分析
• 4.5.3 关于PON1/Alu I 位点多态性及相关分析
• 4.5.4 关于品种间的比较分析
• 4.6 关于荧光定量和RT-PCR 分析基因在组织中的表达情况
• 4.7 关于真核基因在原核生物中的表达分析
• 第五章 小结
• 5.1 主要的研究结果
• 5.2 本研究的创新点
• 5.3 本研究的不足之处及由此所应思考的问题
• 参考文献
• 附录
• 附录一 GENBANK 收录的AKAP10 基因的CDNA 序列
• 附录二 GENBANK 收录的PON1 基因的CDNA 序列
• 附录三 GENBANK 收录的PON2 基因的CDNA 序列
• 附录四 GENBANK 收录的SIRT2 基因的CDNA 序列
• 英文缩写词ABBREVIATION
• 致谢
• 作者简历