合浦珠母贝贝壳珍珠层形成机理的研究

论文摘要

合浦珠母贝（Pinctada fucata）贝壳由外向内依次由角质层、棱柱层、珍珠层及贝壳内层膜构成。珍珠层在本质上与珍珠相同,二者都具备优良的材料学性能,因此研究珍珠层的形成机理,对于了解珍珠的形成机制,促进我国珍珠产业和相关学科的发展具有重要意义。本研究从贝壳结构（贝壳内层膜）、珍珠层基质蛋白和外套膜矿化相关蛋白等多个角度对珍珠层形成机理进行了研究。研究发现,珍珠层内表面各区域的内层膜形貌和结构都不均一,外套线外区的贝壳内层膜间或具有双层结构。贝壳内层膜的蛋白组成较单一,主要为贝壳框架蛋白。碳酸钙结晶实验显示,贝壳内层膜蛋白可以抑制方解石结晶和加快碳酸钙沉积速度,推测可能以此方式促进文石（珍珠层）沉积。利用分离的贝壳内层膜作为结晶底质尝试建立了新型矿化体系,新体系可以使合浦珠母贝珍珠层总蛋白的矿化功能发生改变,由抑制方解石生长转变为诱导扁球型文石的沉积,推测珍珠层蛋白可以与贝壳内层膜共同诱导文石的沉积并且调控新生文石的生长取向,以此调控珍珠层的生长。利用超纯水溶解和阳离子交换层析法从合浦珠母贝珍珠层中提纯出一种新型的非酸性基质蛋白N40,N40含Gly和Ala丰富,可能属于贝壳丝状蛋白。碳酸钙结晶实验显示,N40可以在方解石结晶溶液中高效率地诱导文石产生,推测以此促进珍珠层沉积。N40的功能是对现行珍珠层有机基质模型的有益补充。以重组的合浦珠母贝钙调素类似蛋白（calmodulin-like protein, CaLP）为探针在珍珠层蛋白中检测到一种可能的CaLP结合蛋白。实验表明,CaLP可以与其结合蛋白共同诱导文石的产生。贝壳原位免疫实验显示,CaLP可能分布在贝壳棱柱层的棱柱周围以及棱柱层和珍珠层之间的有机夹层中。推测CaLP在贝壳形成过程中具有多重作用:分布在棱柱周围的CaLP可以调控棱柱（方解石）的生长,而分布在有机夹层中的CaLP则可能结合在偏碱性的贝壳框架蛋白上,与珍珠层中其结合蛋白共同参与珍珠层沉积的起始。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 生物矿化
• 1.1.1 生物矿化的概念
• 1.1.2 生物矿化的过程与机理
• 1.1.3 生物矿化研究的意义
• 1.2 软体动物的矿化系统与珍珠的形成
• 1.2.1 软体动物的矿化系统
• 1.2.2 珍珠的形成
• 1.2.3 珍珠层形成机理的研究进展
• 1.2.4 贝壳内层膜研究概述
• 1.3 贝壳基质蛋白的研究进展
• 1.3.1 贝壳基质蛋白的分类与概述
• 1.3.2 贝壳基质蛋白的获取
• 1.3.3 贝壳基质蛋白分类汇总
• 1.3.4 贝类矿化相关蛋白汇总
• 1.3.5 合浦珠母贝主要的贝壳基质蛋白
• 1.4 研究目的与意义
• 1.5 论文各部分主要研究内容
• 第2章 合浦珠母贝贝壳内层膜的形貌观察与生化分析
• 摘要
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 SEM 样品制备与观察
• 2.2.2 贝壳内表面的拉曼光谱分析
• 2.2.3 贝壳内层膜蛋白组分的分离提取
• 2.2.4 SDS-PAGE 电泳
• 2.2.5 氨基酸组成分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 贝壳内表面的分区与全貌
• 2.3.2 贝壳内层膜形貌
• 2.3.3 贝壳内层膜的双层结构
• 2.3.4 贝壳内层膜蛋白的生物化学特性
• 2.4 讨论
• 2.4.1 不均一的贝壳内表面
• 2.4.2 动态的贝壳内层膜
• 2.4.3 贝壳内层膜的蛋白种类
• 第3章 合浦珠母贝贝壳内层膜的生物矿化功能分析
• 摘要
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 贝壳内层膜可溶蛋白的提取
• 3.2.2 合浦珠母贝珍珠层水溶性总蛋白的提取
• 3.2.3 蛋白浓度的测定
• 3.2.4 体外碳酸钙结晶实验
• 3.2.5 体外碳酸钙结晶速度实验
• 3.2.6 晶体的鉴定
• 3.2.7 以贝壳内层膜为结晶底质的新矿化体系的建立
• 3.3 结果
• 3.3.1 贝壳内层膜蛋白对碳酸钙结晶的影响
• 3.3.2 珍珠层水溶性蛋白对方解石生长的抑制
• 3.3.3 贝壳内层膜与珍珠层蛋白共同诱导文石生长
• 3.4 讨论
• 3.4.1 贝壳内层膜蛋白的矿化功能
• 3.4.2 贝壳内层膜对方解石结晶的抑制
• 3.4.3 珍珠层水溶总蛋白的生物矿化功能
• 3.4.4 体外碳酸钙矿化体系
• 第4章 新型珍珠层基质蛋白N40 的纯化与矿化功能研究
• 摘要
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 珍珠层水溶性总蛋白的提取
• 4.2.2 N40 的纯化
• 4.2.3 蛋白质银染
• 4.2.4 MALDI-TOF MS
• 4.2.5 氨基酸组成分析与SDS-PAGE
• 4.2.6 体外碳酸钙结晶实验及晶体鉴定
• 4.3 结果
• 4.3.1 N40 的生物化学特性
• 4.3.2 N40 诱导文石沉积
• 4.4 讨论
• 4.4.1 贝壳珍珠层蛋白的提取与纯化方法
• 4.4.2 “不可溶”的N40 蛋白
• 4.4.3 N40 的生物矿化功能
• 第5章 钙调素类似蛋白（CALP）的生物矿化功能研究
• 摘要
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 CaLP 工程菌的构建及重组蛋白的表达与纯化
• 2+迁移电泳实验'>5.2.2 Ca²⁺迁移电泳实验
• 5.2.3 EDTA 可溶的珍珠层蛋白的提取与检测
• 5.2.4 利用生物素标记合浦珠母贝CaLP
• 5.2.5 蛋白转膜
• 5.2.6 CaLP 重组蛋白亲和印迹
• 5.2.7 CaLP 结合蛋白的纯化
• 5.2.8 体外碳酸钙结晶实验与晶体鉴定
• 5.2.9 贝壳原位免疫组织化学实验
• 5.3 结果
• 5.3.1 重组合浦珠母贝CaLP 的表达纯化与性质鉴定
• 5.3.2 生物素有效标记的CaLP
• 5.3.3 珍珠层总蛋白的聚合特性
• 5.3.4 珍珠层中的CaLP 结合蛋白
• 5.3.5 CaLP 与其结合蛋白共同诱导文石沉积
• 5.3.6 CaLP 影响方解石晶貌
• 5.3.7 CaLP 在贝壳中的分布
• 5.4 讨论
• 5.4.1 重组合浦珠母贝CaLP 的表达与纯化
• 5.4.2 CaLP 结合蛋白的分布与检测方法
• 5.4.3 贝壳基质蛋白的聚合特性与纯化方法
• 5.4.4 CaLP 与其结合蛋白的矿化功能
• 5.4.5 CaLP 在珍珠层形成过程中的作用
• 第6章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文