抗白念珠菌人鼠嵌合抗体真核表达载体的构建与表达

论文摘要

近年来,随着HIV感染者的增加、异种移植术的开展、肿瘤发病率的上升,免疫受损人群不断扩大,真菌感染性疾病越来越被关注[1]。其中白念珠菌感染是发病率最高、影响最为广泛的一类真菌疾病[2]。而目前的抗真菌药物大多毒副作用较大,而且真菌的耐药性迅速增加。因此临床迫切需要安全和特效的抗真菌药物[3]。人们一直在探索抗真菌生物学治疗手段,其中基因工程抗体是一种重要的策略[4]。近年来基因工程抗体技术的迅猛发展,为许多疾病的临床诊断和治疗提供了新的思路。嵌合抗体是目前研究较多、也较为成熟的基因工程抗体。它在降低鼠源性单抗的免疫原性的同时,最大限度地保留了亲代鼠源单抗的抗原结合特异性和亲和性;在人体内半衰期较鼠源单抗长,生物学功能也较强;还可根据需要更换IgC区基因的类别、型或亚型,从而改变抗体Fc段的功能。自从1984年Morrison[5]首次成功研制人鼠嵌合抗体以来,现已有多种嵌合抗体用于临床,取得了良好的效果[6]。众多临床试验表明,嵌合抗体应用于人体是安全的,且较改型的人源化抗体能更好地保留亲本鼠单抗的亲和力和特异性[6, 7]。国外多个实验室的研究提示抗白念珠菌抗体具有良好的抗真菌作用,并预示了良好的临床应用前景[8, 9]。本研究组在前期工作中获得了单克隆天然抗体3B4,并发现3B4对白念珠菌有高特异亲和性和明确的抗白念珠菌作用[10]。本研究采用基因工程技术对鼠源性单抗3B4进行了人源化改造,将鼠源抗体可变区与人抗体恒定区相连接,构建了抗白念珠菌人鼠嵌合抗体真核表达载体,进行了真核表达,并初步鉴定了嵌合抗体的生物学活性。一、抗白念珠菌人鼠嵌合抗体真核表达载体的构建从含有单克隆天然抗白念珠菌抗体3B4可变区基因的载体pMDT-V2H和pUC-VL中PCR克隆鼠源单抗3B4的可变区VH和VL基因,依次插入含有人免疫球蛋白κ轻链恒定区基因和γ1重链恒定区基因的真核表达载体pMH-CA中,将抗白念珠菌鼠源单抗的可变区与人IgG1恒定区连接。经酶切和DNA序列测定正确后,成功构建人鼠嵌合基因工程抗体的真核表达载体PHK。二、抗白念珠菌人鼠嵌合抗体的真核表达和生物活性鉴定采用电穿孔方法转染小鼠浆细胞瘤细胞系J558L细胞进行嵌合抗体的真核表达,RT-PCR、ELISA方法对抗体表达进行鉴定。RT-PCR和DNA序列测定显示人鼠嵌合抗体重链和轻链在mRNA水平正确地转录和剪切,ELISA证实了抗白念珠菌人鼠嵌合抗体的表达以及对角蛋白和白念珠菌芽管的结合活性。本研究成功构建了抗白念珠菌人鼠嵌合抗体的真核表达载体,成功转染真核细胞,并表达出具有结合活性的基因工程抗体。为下一步嵌合抗体的功能和临床应用研究奠定了基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 一.基因工程抗体的分类及研制进展
• 二.人-鼠嵌合抗体构建技术的研究进展
• 三.基因工程抗体表达体系的研究进展
• 四. 基因工程技术在白念珠菌感染诊断治疗中的应用
• 正文
• 实验一 抗白念珠菌人鼠嵌合抗体真核表达载体的构建
• 1 材料
• 1.1 主要实验仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 载体和菌株
• 1.4 主要试剂的配制方法
• 2 方法
• 2.1 常用分子生物学实验方法
• 2.2 鼠单抗3B4 轻、重链可变区基因的克隆
• 2.3 真核表达载体和鼠抗3B4 重链可变区的连接
• 2.4 真核表达载体和鼠抗3B4 轻链可变区的连接
• 3 结果
• 3.1 鼠抗3B4 轻、重链可变区基因的扩增
• 3.2 重组载体的鉴定
• 3.3 鼠抗3B4 轻、重链可变区基因的序列分析
• 4 讨论
• 实验二 抗白念珠菌人鼠嵌合抗体真核表达及活性鉴定
• 1 材料
• 1.1 主要实验仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 细胞载体和实验菌种
• 1.4 主要试剂配制方法
• 2 方法
• 2.1 人-鼠嵌合抗体的瞬时表达
• 2.2 嵌合抗体的生物活性检测
• 3 结果
• 3.1 RT-PCR 检测嵌合抗体的表达
• 3.2 序列测定结果
• 3.3 ELISA 实验
• 4 讨论
• 4.1 关于人鼠嵌合的策略
• 4.2 表达细胞的选择
• 4.3 表达载体和转染方式的选择
• 4.4 实验存在的问题
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢