鼠巨细胞病毒感染小鼠星形胶质细胞对共培养T细胞功能及调节性T细胞分化的影响

论文摘要

论文一MCMV感染小鼠星形胶质细胞对共培养T细胞功能及调节性T-N胞分化的影响【目的】①在体外细胞水平研究巨细胞病毒感染星形胶质细胞对T细胞免疫的影响；②探明巨细胞病毒感染对星形胶质细胞—T淋巴细胞共培养系统中调节性T细胞亚群分化扩增的影响及其可能机制；③研究大蒜新素对巨细胞病毒感染引起的调节性T细胞比率失衡的作用并探讨其机制。【方法】①MCMV感染星形胶质细胞模型的建立：进行BALB／c小鼠星形胶质细胞的原代和传代培养；使用免疫组化法检测特异性标志物验证星形胶质细胞的纯度；给予MCMV攻击星形胶质细胞后，通过观察细胞病变、含Lac-Z基因重组病毒株MCMV RM461的X-gal显色，以及绘制病毒生长曲线等方法判定传代星形胶质细胞对MCMV的易感性和感染状态。②T淋巴细胞—MCMV感染星形胶质细胞共培养系统的建立：提取MCMV预感染BALB／c小鼠2个月后的脾脏和淋巴结，使用尼龙毛法分离纯化T淋巴细胞；流式细胞术检测所获淋巴细胞中CD3+细胞的比率，验证T淋巴细胞的纯度；MCMV感染星形胶质细胞（感染复数为0.01）后，与分离获得的T淋巴细胞共培养。③观察T淋巴细胞—MCMV感染星形胶质细胞共培养系统中T细胞免疫的状况：采用克隆观察法和荧光素CFDA-SE标记流式细胞术检测的方法来研究T细胞增殖状况；双抗体夹心ELISA法检测共培养上清中Th1类细胞因子IFN-γ和TNF-α水平来评估T细胞活化分泌水平；采用细胞病变观察法和PCR检测星形胶质细胞中MCMV DNA负荷量变化来判断T细胞是否能发挥免疫保护作用。④研究MCMV感染对T淋巴细胞—星形胶质细胞共培养系统中调节性T细胞分化、种群扩增的影响：分别于共培养前和共培养后24h、48h、72h，使用RT-PCR法检测T细胞中Foxp3 mRNA表达水平的变化；使用流式细胞术检测CD4+CD25+细胞在CD4+细胞中所占比率的变化；使用单向混合淋巴细胞反应观察与感染星形胶质细胞共培养72h后T细胞增殖能力的变化。⑤采用RT-PCR法研究MCMV感染对星形胶质细胞TGF-beta mRNA表达的影响。⑥研究大蒜新素处理对MCMV感染星形胶质细胞—T细胞共培养系统中调节性T细胞的影响：使用MTT法测定星形胶质细胞对大蒜新素的最大耐受浓度（MTC）；MTC大蒜新素处理共培养的MCMV感染星形胶质细胞与T细胞72h后，采用RT-PCR法检测T细胞中Foxp3 mRNA表达水平的变化；使用流式细胞术检测CD4+CD25+细胞在CD4+细胞中所占比率的变化。⑦采用RT-PCR法观察MTC大蒜新素处理的MCMV感染星形胶质细胞中TGF-beta mRNA表达的影响，探讨药物影响病毒诱导Treg分化扩增的机制。【结果】①获得高纯度（＞95％）的传代星形胶质细胞。其被MCMV感染后，能够产生典型细胞病变，表达MCMV重组毒株的Lac-Z基因，并释放出具有感染能力的子代病毒。病毒生长曲线显示，MCMV能在星形胶质细胞内较快速的复制繁殖，说明传代星形胶质细胞充分支持MCMV的产毒性感染。②使用尼龙毛法分离获得较高纯度的T淋巴细胞，CD3阳性率＞95％。成功建立T淋巴细胞—MCMV感染星形胶质细胞共培养模型。③T淋巴细胞—MCMV感染星形胶质细胞共培养3d，可观察到T细胞聚集和克隆生成；CFDA-SE标记流式细胞术检测证明，MCMV感染组T细胞增殖率为6.68±0.61％，与非感染对照（1.07±0.03％）相比较有统计学差异（P＜0.01）。MCMV感染组培养上清中IFN-γ浓度为22.9±3.35pg／ml，但TNF-α水平低于试剂盒检测范围（＜8pg／ml），非感染对照中2种因子均未检出。T细胞共培养3d，能够减少31.25％～75％的星形胶质发生细胞病变，抑制率随添加T细胞比例增多而增高；同时MCMV DNA载量也明显减少，PCR显示MCMV DNA扩增条带明显减弱。④T淋巴细胞—MCMV感染星形胶质细胞共培3d的培养上清也能够减少MCMV感染导致的星形胶质细胞病变，抑制率达81.25％；能够明显减少MCMV DNA载量，抑制率为70％。⑤与MCMV感染星形胶质细胞共培养3d后的T细胞再次接触MCMV感染星形胶质细胞时，发生增殖的细胞比率明显降低，仅1.83±0.25％，与新分离的T细胞相比有统计学差异（P＜0.05）；未能检出IFN-γ的分泌；不能抑制病毒导致的细胞病变；对MCMV DNA载量无影响（与病毒感染对照相比，P＞0.05），提示共培养3d后的T细胞功能受到抑制。⑥T细胞Foxp3 mRNA表达和CD4+CD25+细胞比率变化相似，在与MCMV感染星形胶质细胞共培养24h后均已明显增多，并随时间延长而有逐渐增多趋势，在共培养后72h增长最为明显，与共培养前和非感染对照相比有显著差异（P＜0.01）。在单向混合淋巴细胞反应中测得与感染星形胶质细胞共培养3天T细胞的刺激指数为1.18±0.06，明显低于对照组的1.78±0.13（P＜0.01），说明T细胞的增殖能力在与感染星形胶质细胞共培养72h后受到抑制。⑦在CMV感染后72h，星形胶质细胞的TGF-beta mRNA表达显著上调，比正常对照升高了近一倍（P＜0.01）。⑧MTT法测得星形胶质细胞对大蒜新素的最大耐受浓度为9.6μg／mL。用9.6μg／mL大蒜新素处理，可以降低感染共培养系统中T细胞Foxp3 mRNA的表达水平（P＜0.01）和CD4+CD25+T细胞比率（P＜0.01）；但仍高于正常对照组（P＜0.05）。MCMV感染星形胶质细胞中TGF-beta mRNA表达水平在9.6μg／mL大蒜新素处理后也明显降低（P＜0.05），但仍然高于正常细胞对照（P＜0.01）。【结论】①成功建立MCMV感染星形胶质细胞—T淋巴细胞共培养模型，为研究巨细胞病毒中枢神经系统感染免疫提供体外细胞水平研究的平台。②小鼠星形胶质细胞在感染CMV后能够刺激T细胞增殖活化；T细胞免疫能够发挥一定程度的保护作用，这种保护作用有部分是由分泌性的细胞因子介导的；T细胞活化后功能很快受到抑制，其中存在复杂的机制。③CMV感染星形胶质细胞后能促进共培养T细胞内Foxp3基因表达和Treg比例上升；增多的Treg可能发挥一定的免疫抑制功能。CMV感染导致星形胶质细胞TGF-beta表达水平升高，可能是其促进Treg诱导分化，实现Treg种群扩增的重要机制。中枢神经系统的环境有利于Treg的分化，是机体免疫自稳的重要保护机制。另一方面，CMV感染诱导病变局部Treg种群扩增，又是其逃避特异性免疫、实现长期潜伏的机制之一。④大蒜新素能部分抵消CMV感染导致的Treg比率失衡，抑制TGF-beta表达可能在其中发挥作用。药物通过影响Treg进而增强特异性细胞免疫功能而有利于机体清除CMV病毒，可能是大蒜新素抗CMV效应的另一作用机制。论文二大蒜新素抑制人巨细胞病毒即刻早期基因表达在抗人巨细胞病毒机制中的作用【目的】已有临床资料和实验证明大蒜新素具有抗HCMV活性，但其具体作用机制仍不清楚。本实验室以往的研究发现大蒜新素可以抑制HCMV即刻早期抗原的表达，而后者是HCMV复制周期中必不可少的环节、并与病毒的致病机制密切相关。这给我们研究大蒜新素的作用机制提供了线索。在本实验中，将从病毒复制周期的角度出发，着眼于药物对即刻早期基因表达的影响，研究大蒜新素抑制人巨细胞病毒（HCMV）复制的作用环节和机制。【方法】①大蒜新素对人胚肺成纤维细胞的毒性实验：采用MTT法测定人胚肺成纤维细胞对大蒜新素的最大耐受浓度（MTC）。②采用蚀斑抑制法测定大蒜新素抗巨细胞病毒的半数有效浓度(EC50)。③采用时间依赖的药物添加和移除实验分析大蒜新素在HCMV复制周期中的作用环节。④用Southern blot检测大蒜新素处理感染细胞后HCMV DNA负荷量变化。⑤用Northern blot和Western blot检测大蒜新素对HCMV即刻早期（ie）基因转录和翻译的影响。⑥在印迹实验中，大蒜新素采用细胞最大耐受剂量（MTC）和半数有效剂量(EC50)二种浓度，并与相应浓度更昔洛韦进行比较。【结果】①MTT法测得人胚肺成纤维细胞对大蒜新素的MTC为9.6μg／mL，半数毒性浓度(median cytotoxic concentration，IC50)为70μg／mL。②蚀斑抑制法测得大蒜新素抗巨细胞病毒的EC50为4.2μg／mL。计算得到大蒜新素的选择指数（selective index，SI）为16.7（IC50÷EC50=70÷4.2）③在时间依赖的药物添加实验中和发现，只有当大蒜新素在感染前2h到感染后8h之间的时间段添加时，才显示出对病毒滴度不同程度的抑制；而在感染8h后添加，则对最终的病毒滴度无影响。在时间依赖的药物移除实验中，在感染0h即除去大蒜新素，对病毒复制无影响；在感染后2～4h移除药物，显示出部分抑制效应；在感染后8～60h移除药物，均显示完全的抑制效应。④Southern blot显示大蒜新素和更昔洛韦均能减少HCMV DNA负荷量，两药相当剂量的抑制效应之间相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。⑤Northern blot显示大蒜新素对ie1 mRNA有明显抑制，抑制率达30.38％～46.61％；而更昔洛韦处理组与病毒对照组相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。⑥Western blot显示大蒜新素对IE蛋白表达水平有明显抑制作用，对IE86的抑制尤为明显。在感染后24h（病毒初次表达IE蛋白的高峰期）时，大蒜新素对IE72表达的抑制率为42.6％～64.9％，对IE86表达的抑制率为50.7％～70.6％。到感染后72h时（子代病毒表达IE蛋白的高峰期），大蒜新素对IE蛋白仍有抑制作用，对IE72的抑制率为36.4％～49.3％，对IE86的抑制作用更为明显，抑制率达77.9％～87.7％，相当于对IE72抑制率的2倍。而更昔洛韦对一个HCMV复制周期内IE蛋白表达无抑制作用；对感染后72h时的IE蛋白水平有一定的抑制作用，抑制42.9％～64.3％的IE72表达和45.7％～79.2％IE86的表达，此时对IE86的抑制要弱于大蒜新素的作用。【结论】大蒜新素抑制HCMV ie基因的转录和翻译，进而抑制病毒的复制增殖，是其抗HCMV的重要作用机制。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文一 MCMV感染小鼠星形胶质细胞对共培养T细胞功能及调节性T细胞分化的影响
• 前言
• 第一部分 小鼠星形胶质细胞的体外培养及小鼠巨细胞病毒感染模型的建立
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 T细胞免疫对小鼠星形胶质细胞巨细胞病毒感染的保护作用研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 巨细胞病毒感染星形胶质细胞对调节性T细胞的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 大蒜新素抑制巨细胞病毒感染星形胶质细胞后调节性T细胞亚群的扩增及其机制的研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 论文二 大蒜新素抑制人巨细胞病毒即刻早期基因表达在抗人巨细胞病毒机制中的作用
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述一
• 综述二
• 附录一 （缩略词表）
• 附录二 （攻读学位期间发表论文目录）
• 致谢