烟草（红花大金元品种）在不同生长时期基因组DNA甲基化的初步研究

论文摘要

DNA甲基化(DNA methylation)是指DNA序列中的部分胞嘧啶碱基受到甲基基团的共价修饰,DNA甲基化是生物表观遗传修饰的一种重要形式。DNA甲基化现象普遍存在于动物、植物及真菌中,在真核生物基因表达、细胞分化及个体发育中发挥着重要的作用。云南是中国第一烟草大省,云南烟草在全国占有举足轻重的地位,烤烟型烟草品种红花大金元(Nicotiana tabacum L.var. Honghuadajinyuan)品质优越,抗逆性强,需肥量少,适应性广,是云南烟区的主要栽培品种之一。本研究以在云南省大理州巍山县(北纬25’13’37.96",东经100’18’25.83’’,海拔2061米)、云龙县(北纬25’53’08.38”,东经99’22’15.77”,海拔1957米)种植的烤烟型烟草品种红花大金元为实验材料,利用甲基敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)技术对大田期烟草叶片生长发育的五个阶段的DNA甲基化水平和样式变化进行研究,本文的研究结果概括如下：MSAP分析结果显示,巍山和云龙地区烟叶样品在其生长发育的还苗期、团棵期、旺长期、现蕾期、成熟期基因组DNA甲基化水平处于一个动态的变化过程,且两个地区的烟草材料发生甲基化的方式都主要以内部胞嘧啶(CmCGG)双链甲基化为主。在五个生长阶段中巍山和云龙两县烟草的第十片叶片在现蕾期甲基化程度都是最低的,这可能与烟草在该阶段生长方式发生改变有关。PCA分析表明：栽培于同一地区的处于相同生长阶段的烟叶之间在以营养生长为主时(还苗期、团棵期、旺长期)DNA甲基化差异比较小,甚至没有差异,而在由营养生长向生殖生长转变的现蕾期开始,处于相同生长阶段的第四片烟叶和第十片烟叶之间的甲基化差异逐渐增大,到达烟叶发育的成熟期时,DNA甲基化在第四片叶和第十片叶之间的差异也达到最大,这可能反映了生长发育阶段对甲基化模式的影响。同时,不同地域环境种植的相同品种烟草的甲基化变化也出现较为明显的差异,环境因子对于烟草叶片基因表达模式产生了不可忽略的影响,这正好印证了地区间烟叶评吸风格特征各不相同的经验。在发育过程中,除甲基化水平有变化外。相邻发育阶段烟草叶片的基因组"CCGG"位点甲基化模式也存在较大差异,分为单态性(2种)和多态性(12种)两大类；由旺长期发育到现蕾期阶段以及现蕾期发育到成熟期阶段多态性比例明显较其他阶段高,这可能与烟草在该阶段整个植株发生巨变有关,这些多态性位点可能参与了烟叶剧烈的发育和生理的变化过程。烟草叶片在整体发育过程中的甲基化模式变化更加复杂,在烟草叶片生长发育过程中同时存在DNA的甲基化和去甲基化现象。部分位点高频率、反复的变化可能与发育有关,但也不排除与环境中某种反复出现的变化因子有关。对烟叶整体发育过程中甲基化模式的变化研究表明,本研究所涉及的甲基化位点中,约有47%左右的位点可能参与到叶片的正常生长、发育和功能体现中；另外,有53%左右的位点的甲基化复杂变化可能与综合环境因素以及内共生菌的代谢参与相关。研究结果初步揭示了烟草叶片生长发育过程中DNA甲基化水平和样式变化,以及甲基化调控的复杂性,为进一步研究烟草烟叶发育的表观遗传和特异基因表达的调控机制提供了部分基础数据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1 DNA甲基化与表观遗传
• 1.1 表观遗传学的基本概念
• 1.2 DNA甲基化的概念
• 2 植物DNA甲基化模式及相关酶类
• 2.1 植物DNA甲基化模式
• 2.2 参与植物DNA甲基化的酶类
• 3 DNA甲基化在植物基因组中的分布及含量
• 4 DNA甲基化在植物生长发育中的作用
• 4.1 在基因组防御中的作用
• 4.2 DNA甲基化与植物的春化作用
• 4.3 植物DNA甲基化调节植物内源基因的表达
• 4.4 DNA甲基化模式的传递及遗传性
• 5 植物DNA甲基化的研究方法
• 5.1 基因组整体水平甲基化分析
• 5.2 特定DNA片段的甲基化分析
• 6 烟草烤烟型品种红花大金元的概述
• 7 大田期烤烟生长发育特点
• 7.1 大田期不同阶段烤烟生长发育特点
• 8 本研究的目的和意义
• 9 技术路线
• 第二章 材料与方法
• 1 材料和试剂
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 DNA的提取
• 2.2 MSAP分析
• 2.3 选择性扩增产物的银染检测
• 2.4 数据统计与分析
• 2.5 多态性带的回收,克隆,测序及序列分析
• 第三章 结果与分析
• 1 不同发育时期样品的采集
• 2 提取基因组DNA分析
• 3 MSAP分析
• 3.1 引物筛选
• 3.2 烤烟品种红花大金元在发育过程中基因组DNA甲基化水平的初步分析
• 3.3 相同地区同一发育阶段不同叶片及不同地区相同烟草品种的甲基化差异
• 3.4 烟草叶片不同生长阶段的甲基化模式变化
• 3.5 多态性条带的回收、克隆以及测序
• 第四章 讨论
• 1 不同的DNA提取方法对烟草基因组DNA质量的影响
• 2 烟草生长发育过程中基因组DNA甲基化水平的变化
• 3 相同生长阶段不同发育程度叶片在相同地区的DNA甲基化差异
• 4 不同地区烟叶甲基化模式变化
• 5 DNA甲基化模式在烟草叶片生长发育过程中的改变
• 5.1 烟叶相邻发育阶段DNA甲基化变化的多样性
• 5.2 烟草叶片整体发育过程中DNA甲基化变化模式的复杂性
• 第五章 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢