甘蔗叶片cDNA文库构建及SPS前体mRNA选择性剪接初步研究

论文摘要

甘蔗是世界上最重要的糖能兼用作物。本研究应用LD-PCR方法合成cDNA二链,琼脂糖胶回收法分级纯化回收双链cDNA,回收产物克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,获得了甘蔗高糖品种（FN95-1702）叶片cDNA文库。文库库容为1.8×106个克隆,重组率达98.6%,插入片段长度集中在0.6～2.5 kb,平均插入片段长度约为1.2 kb。利用该文库克隆了果糖-1,6-二磷酸酯酶基因、ADP/ATP转运蛋白酶基因和天冬氨酸蛋白酶基因的cDNA片段,并对其进行了生物信息学分析。研究结果可为甘蔗糖代谢及胁迫信号转导研究提供基础。本研究从甘蔗叶和茎中获得了糖代谢途径的关键酶——蔗糖磷酸合成酶基因的6个不同长度的cDNA片段。经RT-PCR分析初步证明了这是SPS的不同形式的剪接体,SPS前体mRNA具有选择性剪接现象。进一步的RT-PCR实验表明,在1个斑茅品种和9个不同的甘蔗品种中均存在SPS前体mRNA的选择性剪接现象。这在植物SPS上是首次发现。选择性剪接现象的发现,可为SPS前体mRNA选择性剪接机理研究奠定基础,更可为在转录水平上调控SPS的表达提供新的研究方向。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 第1章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 构建全长cDNA文库的方法比较及其应用
• 1.2.2 前体mRNA选择性剪接分子机制研究进展
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第2章 甘蔗叶片cDNA文库的构建及基因克隆
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料与菌株
• 2.1.2 主要试剂和酶
• 2.2 方法
• 2.2.1 总RNA提取
• 2.2.2 RNA质量检测
• 2.2.3 mRNA的分离
• 2.2.4 cDNA文库构建
• 2.2.5 基因克隆及生物信息学分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 甘蔗总RNA的提取
• 2.3.2 mRNA的分离
• 2.3.3 双链cDNA的合成
• 2.3.4 双链cDNA与载体的连接效率分析
• 2.3.5 转化 E.coli DH 5α转化效率分析
• 2.3.6 测定未扩增文库库容和重组克隆百分比
• 2.3.7 cDNA文库插入片段长度的PCR检测
• 2.3.8 基因克隆及生物信息学分析讨论
• 2.4 讨论
• 2.4.1 LD-PCR在cDNA文库构建中的应用
• 2.4.2 双链cDNA的纯化回收
• 2.4.3 T载体在cDNA文库构建中的应用
• 2.4.4 减少cDNA文库构建中间步骤的作用
• 第3章 SPS前体mRNA剪接体的克隆和序列分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 材料与菌株
• 3.1.2 主要试剂和酶
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 核酸提取
• 3.2.2 PCR引物的设计与合成
• 3.2.3 PCR反应及其产物回收
• 3.2.4 回收产物的连接和转化
• 3.2.5 重组质粒的提取和PCR检测酶切鉴定
• 3.2.6 测序及序列分析
• 3.2.7 RT-PCR检测SPS选择性剪接体
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 核酸的提取
• 3.3.2 SPS的cDNA片段克隆
• 3.3.3 重组质粒的提取和PCR检测、酶切鉴定
• 3.3.4 测序及序列分析
• 3.3.5 RT-PCR检测SPS的选择性剪接
• 3.3.6 SPS不同剪接体的序列分析
• 3.3.7 SPS出现不同形式剪接体的可能分子机制讨论
• 结论
• 附录1 符号缩略表
• 附录2 溶液配方
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历