大鼠Smad7真核表达质粒的构建及在肝星状细胞中抗纤维化特性研究

论文摘要

目的:肝纤维化（HF）是多种慢性肝病病情发展的共同病理基础和病理特征,是临床肝病向肝硬化发展的中间环节,是可逆性病变,以细胞外基质（ECM）增加为特征。转化生长因子β（TGF-β）是肝纤维化发生发展过程中最重要的促进因子,是ECM沉积的关键介质,肝星状细胞（HSC）活化则是其中心环节。Smad蛋白是信号转导蛋白,介导TGF–β由细胞膜进入细胞核,Smad7负性调控TGF-β的信号转导。本研究构建并鉴定大鼠Smad7基因pcDNA3.1（+）真核表达质粒,脂质体介导转染HSC-T6细胞,旨在观察外源Smad7基因可否有效转染肝星状细胞并初步研究其抗纤维化的效果,为进一步探讨Smad7在TGF-β/Smad信号转导中的抗纤维化机制及用于肝纤维化治疗做准备。方法:根据大鼠Smad7基因全序列,设计特异性引物,TRIzol法抽提冰冻大鼠肝组织总RNA,RT-PCR获得Smad7 cDNA片段,应用分子克隆技术构建Smad7/pcDNA3.1（+）重组质粒,双酶切证实的阳性克隆进行测序鉴定。脂质体介导转染HSC-T6,分为正常对照、空质粒组及转染组,运用免疫细胞化学染色法检测HSC中Smad7及α-SMA定位和表达,分别采用RT-PCR法和Western-blot法检测HSC中Smad7 mRNA及蛋白水平的表达;Western-blot检测α-SMA表达;RT-PCR检测TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达。结果:成功构建大鼠Smad7真核表达质粒;Smad7及α-SMA在胞浆中表达,α-SMA表达阳性提示HSC-T6被激活;Smad7转染组与正常对照、空质粒组比较:Smad7mRNA表达显著增加1.053±0.009 （P=0.009）,蛋白水平明显上调0.083±0.016（P=0.020）,α-SMA蛋白水平明显下降0.518±0.085 （P=0.032）;Smad7转染组TGF-β1、Ⅰ型胶原mRNA表达降低0.961±0.013、0.592±0.096 （P=0.000;P=0.004）;Ⅲ型胶原mRNA表达差异无统计学意义0.910±0.018 （P=0.950）。正常对照、空质粒组Smad7mRNA和蛋白水平、α-SMA蛋白水平、TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达差异无统计学意义（P=0.944,0.644,0.612,0.595,0.967,0.950）。结论:1、大鼠Smad7/PcDNA3.1（+）真核细胞表达重组质粒构建成功;2、Smad7及α-SMA在细胞浆中表达,α-SMA表达阳性提示HSC-T6被激活;3、外源Smad7可有效转染HSC-T6,显著上调Smad7mRNA和蛋白表达水平;4、外源Smad7可使HSC-T6细胞中的α-SMA蛋白表达减少,即活化HSC数量减少,提示Smad7过表达在一定程度上可以使ECM的合成下降;5、Smad7过表达影响TGF-β1及Ⅰ型胶原mRNA的表达水平,提示其参与TGF-β/Smad信号转导,可能在一定程度上具有抗纤维化的生物学活性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词表
• 前言
• 第一部分：大鼠Smad7真核表达质粒的构建与鉴定
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 3 测序
• 结果
• 讨论
• 第二部分：外源Smad7对肝星状细胞Smad7mRNA及蛋白表达的影响
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 3 统计学处理
• 结果
• 讨论
• 第三部分：Smad7 过表达对肝星状细胞的影响及意义
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 3 统计学处理
• 结果
• 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 作者简介
• 导师评语