利用DDRT-PCR技术研究AM真菌侵染紫穗槐过程中相关基因

论文摘要

丛枝菌根（arbuscular mycorrhiza,AM）是一种广泛存在的内生菌根,能增强植物对矿质营养元素（尤其是磷元素）和水分的吸收,减缓干旱危害和保持土壤结构,促进植物的生长。AM共生过程是一个多方面参与并精细协调的信号事件,共生体系中的双方相互识别并发生一系列复杂的形态学和生理学变化。本实验选用木本豆科植物代表树种紫穗槐（Amorpha fruticosa）及AMF摩西球囊霉（Glomus mosseae）,利用mRNA差异显示技术研究丛枝菌根共生建立过程中的信号识别相关基因,从分子水平上对菌根共生机制、信号转导途径进行深入研究。该研究结果对丰富和发展共生生态学具有重要的理论意义,为更好地利用固氮树种资源、菌根技术和提高共生固氮的效率都将产生重要的现实意义。首先,选取三种总RNA提取的方法:Biozol法、SDS/酚法、CTAB法,对侵染率分别为0%、10%、30%、50%、100%的接种AMF（arbuscular mycorrhizal fungi,AMF）与接种灭活的AMF对照处理的紫穗槐根部提取总RNA,通过测定其吸光度值计算其纯度和1.1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整度,结果表明,在五个不同侵染率,均为Biozol法提取的总RNA纯度高,质量好,且提取时间较短仅需2-3h。将效果较好的Biozol方法提取的侵染率为0%（前期）和30%（后期）的总RNA进行纯化并反转录成cDNA。其次,用20条随机引物和3条锚定引物扩增cDNA,PCR产物经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。本试验共获得了169条差异显示的表达片段,前期为63条,后期106条。对169条中的30条进行反Northern杂交验证。经过统计,前期的差异片段阳性率为42%,而后期的假阳性率较高为61%,共得到12条阳性差异片段。最后,对阳性差异条带进行克隆测序,大部分为250-500bp左右。并且已经提交NCBI上的EST库,其在GenBank上的序列号为:GW317173,GW327914,GW327915,GW327873,GW327874,GW327875,GW327876, GW327877,GW327878, GW327879 ,GW327880 ,GW327881。同时,对12条差异片段进行Blastx比对分析,其中,DD-1与蓖麻属的假定蛋白相似性较高,DD-2与同源域-亮氨酸拉链蛋白有关,调控植物特有的发育进程,以及对包括外界胁迫在内的环境信号的应答;DD-3与ATP结合盒蛋白有关,可以帮助代谢产物、离子、糖、氨基酸、脂类、固醇以及药物等多种底物通过细胞内、外膜;DD-4与阿耶罗菌属和青霉菌属的假定蛋白相似;DD-5与大麦的呼吸氧化酶基因相似,在菌根共生的前期阶段,形成丛枝菌根时,最明显的植物生理变化就是植物的呼吸作用增加; DD-7与黄杆菌属的基因组有较大的相似性;DD-8与乙酰转移酶相关,对蛋白质的稳定性和活性产生重大影响;DD-9与阿耶罗菌属假定蛋白相似性较高;DD-10与苜蓿中核糖核酸酶H相似;DD-11在拟南芥中克隆的转座子基因序列相似;DD-12与色素蛋白有关,而色素蛋白主要是在植物进行光合作用中有重要的作用。其中,DD-6没有相似性高的基因或是相关蛋白基因。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 丛枝菌根概述
• 1.1.1 丛枝菌根
• 1.1.2 丛枝菌根真菌
• 1.1.3 丛枝菌根生理作用
• 1.2 丛枝菌根之间共生信号识别
• 1.2.1 共生体建立过程
• 1.2.2 共生体信号识别物质及基因研究进展
• 1.3 紫穗槐概述
• 1.4 mRNA 差异显示技术概述
• 1.4.1 差异显示技术原理
• 1.4.2 差异显示技术优缺点
• 1.5 本实验的研究目的与意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要试剂配置方法
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 盆栽实验
• 2.2.2 侵染率测定
• 2.2.3 不同侵染率下根部总RNA 提取方法优化
• 2.2.4 mRNA 差异显示PCR 技术获得相关基因片段
• 2.2.5 差异条带的反Northern 杂交验证
• 2.2.6 差异PCR 产物的克隆、测序
• 2.2.7 EST 的生物信息学分析
• 第3章 结果与分析
• 3.1 侵染率测定
• 3.2 提取RNA 结果
• 3.2.1 RNA 纯度测定（OD 值）
• 3.2.2 RNA 完整性
• 3.3 mRNA 差异显示PCR 技术获得相关基因片段
• 3.3.1 RNA 纯化及反转录结果
• 3.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
• 3.3.3 差异片段二次扩增结果
• 3.3.4 反Northern 杂交结果
• 3.4 克隆及测序
• 3.4.1 PCR 扩增鉴定
• 3.4.2 重组子酶切结果
• 3.4.3 测序结果
• 3.5 差异片段生物信息学分析
• 3.5.1 差异片段T1 的生物信息学分析
• 3.5.2 差异片段T 2 的生物信息学分析
• 3.5.3 差异片段T3 的生物信息学分析
• 3.5.4 差异片段T4 的生物信息学分析
• 3.5.5 差异片段T5 的生物信息学分析
• 3.5.6 差异片段T6 的生物信息学分析
• 3.5.7 差异片段T7 的生物信息学分析
• 3.5.8 差异片段T8 的生物信息学分析
• 3.5.9 差异片段T9 的生物信息学分析
• 3.5.10 差异片段T10 的生物信息学分析
• 3.5.11 差异片段T11 的生物信息学分析
• 3.5.12 差异片段T12 的生物信息学分析
• 第4章 讨论
• 4.1 三种方法提取根部总RNA
• 4.2 mRNA 差异显示
• 4.2.1 获得差异条带
• 4.2.2 反Northern 杂交
• 4.3 差异条带的生物信息学分析
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文