黑曲霉诱变育种产β-葡萄糖苷酶研究

论文摘要

β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21,β-glucosidase）,能水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖,其广泛存在于动植物和微生物体内。近年来,β-葡萄糖苷酶在纤维素降解、食品和医药等多方面得到了广泛的应用,产酶优良菌株的选育、产酶培养基条件的优化是研究的重点。本研究通过紫外线诱变黑曲霉（Aspergillus niger）30786,筛选β-葡萄糖苷酶高活性突变菌株及对优良突变菌株产酶培养基条件进行优化,获得主要结果如下：（1）黑曲霉（Aspergillus niger）30786原始菌株产酶培养基条件优化。首先通过单因素试验研究碳源、氮源、培养基初始pH等条件对β-葡萄糖苷酶酶活的影响,在此基础上,利用响应面试验设计对黑曲霉产β-葡萄糖苷酶的条件进行优化。结果表明玉米芯、硫酸铵、初始pH值对黑曲霉产β-葡萄糖苷酶酶活都有影响,黑曲霉液体发酵生产β-葡萄糖苷酶最佳条件为：玉米芯21.5g/L,硫酸铵6.4g/L,初始pH值5.2；β-葡萄糖苷酶酶活的最大响应值为5.34U/ml。（2）产β-葡萄糖苷酶突变株C112的选育。以黑曲霉（Aspergillus niger）30786为出发菌株,通过紫外诱变方法对该菌株进行改良,经筛选获得一株突变株C112,其酶活稳定。（3）突变株C112产酶培养基条件优化。对筛选得到的黑曲霉突变株C112产β-葡萄糖苷酶液体发酵培养基进行优化。利用Plackett-Burman设计对影响β-葡萄糖苷酶液体发酵的8个因素进行全面考察。结果表明玉米芯、硫酸铵和磷酸二氢钾是影响β-葡萄糖苷酶酶活的主要因子,3者在大于95%的概率水平上差异显著。用最陡爬坡法逼近影响因素的最佳值区域。然后利用中心复合设计,以获得最佳培养基,采用CCD设计,经过响应面分析建立模型,软件预测得玉米芯,硫酸铵,磷酸二氢钾分别为30.7g/L,7g/L,6g/L,此时得到的最大产酶量为7.22U/ml。（4）突变株遗传变异分析。对原始菌株黑曲霉（Aspergillus niger）30786,突变株C112、C206、C12和C89这5株菌株的基因组DNA进行RAPD分析,用20种随机引物。分析结果显示,黑曲霉30786与突变株C112,C206,C12和C89之间的遗传相似系数在0.87-0.89之间,说明它们之间有一定的变异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 产β-葡萄糖苷酶的生物
• 1.2 β-葡萄糖苷酶理化性质
• 1.2.1 相对分子质量
• 1.2.2 最适温度
• 1.2.3 最适pH值
• 1.3 β-葡萄糖苷酶催化反应机制
• 1.4 育种研究进展
• 1.4.1 自然选育
• 1.4.2 诱变育种
• 1.4.3 原生质体育种
• 1.4.4 基因工程育种
• 1.5 紫外线诱变机理
• 1.6 β-葡萄糖苷酶酶活测定方法
• 1.6.1 分光光度法
• 1.6.2 荧光法
• 1.6.3 比色法
• 1.7 β-葡萄糖苷酶的应用
• 1.7.1 β-葡萄糖苷酶在纤维素降解中的应用
• 1.7.2 β-葡萄糖苷酶在果酒增香中的应用
• 1.7.3 其它方面的应用
• 1.8 本研究的主要内容和意义
• 2 黑曲霉（ASPERGILLUS NIGER）30786产酶培养基条件优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 单因素实验
• 2.2.2 响应面实验
• 2.2.3 模型的建立及显著性分析
• 2.2.4 响应因素水平的优化
• 2.2.5 验证结果
• 2.3 结论
• 3 紫外线诱变并筛选突变株
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 培养基及培养条件
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 孢子悬液的制备
• 3.2.2 紫外线诱变黑曲霉30786
• 3.2.3 初步筛选
• 3.2.4 复筛
• 3.2.5 再复筛
• 3.2.6 遗传稳定性
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 β-葡萄糖苷酶酶活的计算
• 3.3.2 诱变剂量的选择
• 3.3.3 初筛结果
• 3.3.4 复筛结果
• 3.3.5 再复筛结果
• 3.3.6 菌种遗传稳定性检测
• 3.4 结论
• 4 黑曲霉突变株C112产酶培养基优化
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 摇瓶产酶实验
• 4.2.2 Plackett-Burman实验设计
• 4.2.3 最陡爬坡法
• 4.2.4 中心复合设计（CCD）
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 Plackett-Burman筛选影响β-葡萄糖苷酶的重要因素
• 4.3.2 最陡爬坡法确定响应区域
• 4.3.3 响应面分析法确定重要因素的最佳水平
• 4.4 结论
• 5 黑曲霉突变株的RAPD分析
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 培养基和主要溶液
• 5.1.3 试剂
• 5.1.4 实验仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 黑曲霉的诱导培养
• 5.2.2 样品的前期处理
• 5.2.3 基因组DNA的提取
• 5.2.4 DNA质量检测
• 5.2.5 PCR扩增
• 5.2.6 RAPD条件优化
• 5.2.7 RAPD图谱分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 基因组DNA
• 5.3.2 不同的引物浓度对RAPD扩增的影响
• 2+浓度对RAPD扩增的影响'>5.3.3 不同的Mg²⁺浓度对RAPD扩增的影响
• 5.3.4 不同的dNTPs浓度对RAPD扩增的影响
• 5.3.5 不同的Taq酶浓度对RAPD扩增的影响
• 5.3.6 优化后的反应体系
• 5.3.7 RAPD结果分析
• 5.4 讨论
• 6 结论与创新点
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 参考文献
• 附录A 缩略词表
• 附录B DNA MARKER
• 附录C 攻读硕士学位期间的主要学术成果
• 致谢