论文题目: 靶向表达长dsRNA诱导骨肉瘤细胞凋亡
论文类型: 博士论文
论文专业: 外科学
作者: 李立文
导师: 胡蕴玉
关键词: 骨肉瘤,基因治疗,凋亡
文献来源: 第四军医大学
发表年度: 2005
论文摘要: 骨肉瘤是高发于青少年的最常见原发性骨肿瘤,其恶性程度高,预后差。虽然随着化疗放疗等辅助治疗手段发展迅速,5年生存率有了大幅度提高,但是肿瘤转移、复发等问题仍然没有得到解决,目前多数学者已将彻底治愈骨肉瘤的希望寄予基因治疗。 有报道表明使用人骨钙素启动子和人端粒酶逆转录酶(humantelomerase everse transcriptase,hTERT)启动子靶向表达前药转换酶如单纯疱疹病毒胸苷激酶表达治疗骨肉瘤可获得满意效果。然而骨钙素启动子在肝、脑和肺组织也有低水平活性,同时hTERT启动子在干细胞、生殖细胞和激活的淋巴细胞均有活性,提示单独使用骨钙素启动子或者hTERT启动子引导治疗基因表达治疗骨肉瘤都存在对正常组织的毒副作用。此外其他的肿瘤基因治疗策略常需表达功能蛋白或功能RNA发挥作用,也不能避免毒副作用的发生,因此建立安全、有效的新型基因治疗策略成为肿瘤基因治疗研究的热点和重点之一。 本课题以骨肉瘤为例,根据长双链RNA可以诱导多种细胞凋亡,设计了一种不表达任何功能蛋白的、基于肿瘤特异性启动子和组织特异性启动子的双因素控制性肿瘤基因治疗方法。该方法的建立不仅为骨肉瘤基因治疗开辟了新的思路,而且大大提高了骨肉瘤基因治疗的安全性,具有较高的学术价值和潜在的应用价值。 目的:建立一种新型安全有效的骨肉瘤基因治疗策略,对其特异性诱导骨肉瘤细胞凋亡的能力进行评价,并初步阐明其作用机制。 方法:①使用删除5’UTR的人骨钙素启动子引导shRNA表达,观察其对外源性荧光素酶基因表达的剔除作用;②重建hTERT核心启动子的转录起点,引导shRNA表达,观察其对外源性荧光素酶基因和内源性P53基因表达的剔除作用;③使用删除5’UTR的人骨钙素启动子和重建转录
论文目录:
目录
缩略语表
中文摘要
英文摘要
前言
1.骨肉瘤基因治疗的现状及存在问题
(1) 骨钙素启动子在骨肉瘤基因治疗中的应用及存在问题
(2) hTERT启动子在骨肉瘤基因治疗中的应用及存在问题
(3) 双重靶向转录策略的实现及存在问题
2.双重转录靶向定位表达长双链RNA策略的提出和理论依据
(1) 双重转录靶向定位表达长dsRNA策略的构思
(2) 双重转录靶向定位表达长dsRNA策略的理论依据
(3) 双重转录靶向定位表达长dsRNA策略的优越性
文献回顾
RNA干扰的研究进展
一、RNA干扰的发现及研究历程
二、RNA干扰的作用机制——在多个水平发挥基因剔除作用
三、实现RNA干扰的方法
(一) 体外合成siRNA或shRNA
(二) 细胞内合成siRNA或shRNA
(三) siRNA表达载体的选择
(四) 将siRNA导入细胞的方法
四、条件性RNA干扰的实现
(一) 利用PolⅢ启动子实现条件性RNA干扰
(二) 利用PolⅡ启动子实现条件性RNA干扰
五、RNA干扰的靶向性
(一) 靶向作用
(二) 靶向转染和靶向转导
(三) 靶向转录
六、RNA干扰技术在基因治疗领域的应用
(一) 治疗肿瘤和遗传性疾病
(二) 治疗病毒性传染病
(三) 治疗其他疾病
七、RNA干扰技术的缺点和不足
(一) 脱靶效应
(二) 激活PKR和2’5’-OAS依赖的信号转导通路
(三) 其它不足之处
正文
1 组织特异性RNA干扰技术平台的建立
1.1 引言
1.2 材料和方法
1.2.1 材料
1.2.2 方法
1.3 结果
1.3.1 自行设计的mini-polyA测序结果
1.3.2 质粒pGL3-shLuc和pGL3-shP53的鉴定
1.3.3 人骨钙素启动子的克隆和pGL3-OCP-shLuc的鉴定
1.3.4 hTERT核心启动子PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果
1.3.5 pGL3-OCP-shLuc对虫荧光素酶表达的抑制作用
1.3.6 pGL3-hTERT-shLuc对虫荧光素酶表达的抑制作用
1.3.7 pGL3-hTERT-shP53对P53表达的抑制作用
1.4 讨论
1.5 结论
2 靶向表达长双链RNA诱导骨肉瘤细胞凋亡
2.1 引言
2.2 材料和方法
2.2.1 材料
2.2.2 方法
2.3 结果
2.3.1 pGL3-hTERT-PP1和pGL3-OCP-PP2的双酶切鉴定
2.3.2 穿梭质粒pDC311-hTERT-PP1的鉴定
2.3.3 穿梭质粒pDC311-dsRNA的鉴定
2.3.4 Ad-dsRNA的鉴定
2.3.5 Ad-dsRNA滴度测定
2.3.6 MTT实验
2.3.7 Annexin V-FITC结合实验
2.3.8 PARP切割
2.3.9 PKR激活和eIF2α磷酸化的测定
2.3.10 Caspase-3和caspase-8活性检测
2.4 讨论
2.5 结论
小结
参考文献
个人简历及研究成果
致谢
发布时间: 2005-07-19
参考文献
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