肉鸡组织的热应激损伤和热休克蛋白60的表达变化

论文摘要

本研究以鸡为实验动物建立了具有实践指导意义的热应激模型。在此基础上采用组织病理学、免疫组织化学、ELISA、荧光定量PCR等方法,研究不同热应激时间对肉鸡不同组织脏器的应激性损伤、Hsp60及其mRNA的表达情况。将120只肉鸡随机分成1组（对照组）、2组（热应激1h组）、3组（热应激2h组）、4组（热应激3h组）、5组（热应激5h组）和6组（热应激10h组）,每组20只。除了对照组不进行热应激处理（温度控制在25±1℃）之外,将其它各热应激组的环境温度在20 min内从室温突然升至37±1℃。按试验设定的时间剖杀对照组肉鸡和热应激处理各组肉鸡,每组受试鸡按要求采集外周血液,经离心制备血清,-20℃保存用于CK和GPT活性检测;分别解剖受试鸡取心脏、肝脏、肾脏和肺脏,一部分固定在4%多聚甲醛中,用于HE染色和免疫组化检测,另一部分置于-70℃保存,用于Hsp60及其mRNA的检测。试验结果显示,持续热应激处理后的肉鸡血液肌酸激酶（CK）和谷丙转氨酶（GPT）均显著升高,CK在2、3、5和10h与对照组差异极显著（P＜0.01）,GPT在3h与对照组差异显著（P＜0.05）,在5h和10h极显著升高（P＜0.01）,提示热应激导致机体损伤随着应激时间延长而加剧。HE染色结果显示,持续热应激处理3h后的肉鸡心脏和肾脏组织均呈现出以颗粒变性和水泡变性为主要特征的不同程度的病理性损伤,并且这种病理损伤随着热应激时间的延长而加重,对照组鸡无以上病理变化。IHC实验结果显示,不管是实验组还是对照组,Hsp60都有表达,在心脏主要定位于心肌纤维上的胞浆中,而在肝脏主要定位于肝细胞胞浆上,肾脏中主要定位于肾小管上皮细胞胞浆上,但是,热应激组鸡Hsp60阳性信号分布不均匀,主要集中于细胞结构相对完整的部位,这个结果提示Hsp60的表达与热应激损伤有关。ELISA结果显示,Hsp60在三个组织的表达量不一样。心脏中Hsp60在热应激2h就极显著升高,并且,在3h、5h和10h一直维持高表达,与对照组比较差异显著。肝脏中Hsp60在热应激后呈下降趋势,在热应激3h时降带最低点,与对照差异极显著,在5h是有个短暂的恢复区,在10h时又显著下降。肾脏Hsp60变化趋势与肝脏相似,但是差异不显著。热应激后Hsp60在三个脏器表达各不相同,提示Hsp60发挥保护作用具有组织依赖性。荧光定量PCR结果显示,心脏中hsp60 mRNA在2h极显著升高,呈现一个峰值,随着热应激时间的延长,逐渐恢复正常。肝脏中hsp60 mRNA在热应激1h就迅速升高,在2h短暂恢复至正常,在3h、5h和10h又逐渐升高,与对照组差异显著。肾脏hsp60 mRNA变化趋势与心脏相似,在2h出现一个峰值极显著升高,然后逐渐恢复正常。hsp60 mRNA热应激后主要表现为升高,且这种表达在不同热时间表现不一样,提示热应激可以诱导hsp60 mRNA的高表达,并且hsp60 mRNA的表达具有时间特异性。热应激不同时间Hsp60在不同组织中的表达不一样,提示Hsp60的表达与热应激引起的损伤不同有关,Hsp60发挥保护作用可能具有组织特异性和时间特异性。上述结果从分子水平揭示热应激后Hsp60以及mRNA的变化情况,为认识热应激发生的机制和Hsp60的保护作用提供新的资料,为寻求应激性疾病的防护措施提供了新的理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号及缩略语说明
• 第一篇 文献综述
• 第一章 热应激与Hsp60
• 1 热应激概述
• 1.1 热应激概念
• 1.2 热应激反应
• 2 热应激对家禽的影响
• 2.1 家禽的生物学特性
• 2.2 热应激对呼吸机能的影响
• 2.3 热应激对家禽神经内分泌机能的影响
• 2.4 热应激对组织器官的影响
• 2.5 急性热应激对血液生化指标的影响
• 3 热休克蛋白Hsp60概述
• 3.1 Hsp60的结构
• 3.2 Hsp60的功能
• 3.3 Hsp60的基因转录调控
• 3.4 Hsp60与疾病
• 3.5 Hsp60与热应激的关系
• 3.6 Hsp60研究中存在的问题
• 参考文献
• 第二篇 试验部分
• 第二章 热应激后肉鸡组织Hsp60的表达及组织应激性损伤
• 1 材料和方法
• 1.1 试验动物及试验设计
• 1.2 主要试剂及仪器
• 1.3 试验方法
• 1.3.1 血液中CK和GPT的检测
• 1.3.2 HE染色
• 1.3.3 免疫组化染色
• 1.3.4 ELISA检测Hsp60
• 1.3.5 实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测组织中hsp60 mRNA
• 1.4 统计分析
• 2 结果和分析
• 2.1 受试鸡的热应激临床症状
• 2.2 急性热应激肉鸡血清中CK和GPT的变化趋势
• 2.3 受试鸡的热应激性组织病理变化
• 2.3.1 心肌
• 2.3.2 肝脏
• 2.3.3 肾脏
• 2.3.4 肺脏
• 2.4 免疫组化结果
• 2.4.1 Hsp60在受试鸡心脏中的分布
• 2.4.2 Hsp60在受试鸡肝脏中的分布
• 2.4.3 Hsp60在受试鸡肾脏中的分布
• 2.5 ELISA检测受检组织中Hsp60的含量
• 2.5.1 心脏中Hsp60的含量
• 2.5.2 肝脏中Hsp60的含量
• 2.5.3 肾脏中Hsp60的含量
• 2.6 实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测组织中hsp60 mRNA
• 2.6.1 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果
• 2.6.2 hsp60 mRNA和GAPDH的标准曲线
• 2.6.3 FQ RT-PCR结果
• 3 讨论
• 3.1 热应激对受试鸡的应激性组织病理损伤
• 3.2 Hsp60在组织中的定位
• 3.3 Hsp60及其mRNA在心脏、肝脏和肾脏中的表达情况
• 3.4 Hsp60及其mRNA的表达特点
• 参考文献
• 全文总结
• 附录
• 致谢
• 论文发表情况