论文摘要
目的:在建立支气管哮喘大鼠模型的基础上,给予咳喘宁干预,通过动物实验,探讨咳喘宁对抗哮喘大鼠气道重塑的作用及其机制,为临床治疗支气管哮喘用药提供实验依据。方法1分组及给药清洁级SD大鼠40只,雌雄各半,体重180—220g,随机分为模型组、咳喘宁高剂量组（以下简称高剂量组）、咳喘宁低剂量组（以下简称低剂量组）、桂龙咳喘宁对照组（以下简称桂龙咳喘宁组）、正常对照组,每组8只。咳喘宁高、低剂量组,桂龙咳喘宁均从第1次哮喘激发开始给药,直至处死,每日1次灌胃,连续4周。给药剂量分别为:咳喘宁高剂量组27g/Kg,咳喘宁低剂量组13.5 g/Kg,桂龙咳喘宁组0.41 g/Kg。正常对照组、模型组以同等剂量生理盐水灌胃,每日1次,直至处死。2模型建立除正常组外,各组参照文献,分别于第1d及第8d大鼠腹腔内注射新鲜配制的卵蛋白溶液1 ml（内含卵蛋白100mg,氢氧化铝100mg）致敏,第15d开始雾化吸入1%卵蛋白激发哮喘,隔日1次,雾化流量5ml/min,每次20min,共6周。以大鼠出现呼吸加快、点头呼吸、口唇发绀、腹肌痉挛、站立不稳等表现为激发成功。正常对照组以生理盐水代替卵蛋白进行腹腔注射及雾化吸入,雾化流量及时间同前。3观察指标3.1咳喘宁对哮喘大鼠支气管病理组织学观察各组大鼠于末次激发后18-24h内取材。10%水合氯醛3.5ml/kg腹腔内注射麻醉处死,麻醉完全后开胸,取右肺中叶4℃4%多聚甲醛固定,脱水、包埋、切片,HE染色观察,以NYD病理切片彩色图象分析仪测量支气管面积及支气管平滑肌面积,并用气管内周长进行标准化。3.2咳喘宁对哮喘大鼠肺组织中Ⅲ型胶原的影响动物完全麻醉处死后,开胸迅速结扎左主支气管,取左肺,称重后移入玻璃匀浆器中,加入2倍肺组织重量的生理盐水,充分研碎,使组织匀浆化。制备好的匀浆放入离心机中以3500r/min离心10min,提取上清液分装,采用放射免疫法测定Ⅲ型胶原的含量。3.3咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）的影响。动物分组、模型建立、用药情况及数据统计处理同前。肺组织MMP-9、TIMP-1含量检测:采用双抗体夹心法ABC-ELISA法测定MMP-9、TIMP-1含量,以每ml匀浆液中蛋白含量（g）进行校正。数据处理同上。3.4咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）的影响动物分组、模型建立、用药情况及数据统计处理同前。支气管-肺组织ET-1含量检测:采用放免法测定,先做预试验,取3-5份做小样,将样品做原倍、1:5、1:20倍稀释,根据小样结果选择合适的稀释度做实验,结果乘以稀释倍数,并同时用测得的匀浆上清蛋白含量来校正。肺组织中NO含量检测:硝酸还原酶法测定,由于NO化学性质活泼,在体内代谢很快转为NO2-和NO3-,而NO2-又进一步转化为NO3-,本法利用硝酸还原酶特异性将NO3-还原为NO2-,通过显色深浅测定其浓度的高低,并同时用测得10%匀浆上清蛋白含量（g）来校正。数据处理同上。3.5咳喘宁对哮喘大鼠支气管-肺组织中转化生长因子β1（TGF-β1）、血管表皮生长因子（VEGF）含量的影响ABC-ELISA法测定VEGF含量:动物完全麻醉处死后,取左肺,称重后移入玻璃匀浆器中,加入2倍肺组织重量的生理盐水,充分研碎,使组织匀浆化制备好的匀浆放入离心机中以3500r/min离心10min,提取上清液分装,采用双抗体夹心法ABC-ELISA法测定VEGF含量,以每ml匀浆液中蛋白含量（g）进行校正。数据处理同上。采用免疫组化半定量法检测TGF-β1含量:另取肺组织石蜡切片,常规脱蜡脱水,微波抗原修复,过氧化氢甲醇溶液灭活内源性过氧化物酶,滴加正常山羊封闭液,室温30min,各组分别滴加1:80配置的兔IgG多抗,4℃过夜,磷酸盐缓冲液（PBS）洗净后,滴加生物素标记的二抗工作液,37℃反应20 min,PBS洗净后加辣根酶标记的链酶卵白工作液,37℃反应20 min,PBS洗5 min,共4次,室温显色,镜下控制反应时间约10 min左右,洗净后苏木精复染,树胶封片。计算机图象处理软件半定量测定TGF-β1表达（以染色吸光度值表示）3.6咳喘宁对支气管哮喘大鼠支气管周围组织细胞凋亡指数及相关基因蛋白Bcl-2、Bax表达的影响。动物分组、模型建立、用药情况及数据统计处理同前。动物麻醉完全后,取右肺中叶4%多聚甲醛固定,脱水、包埋、切片,分别做TUNEL标记和免疫组织化学ABC法染色。采用TUNEL标记法检测细胞凋亡:生物素（biotin）标记的dUTP在TdT酶的作用下可以掺入到凋亡细胞的双链或单链DNA的3′-OH末端,并可与连接了过氧化物酶（POD）的亲和素（streptavidin）特异结合,在POD底物存在的情况下,可产生很强的颜色反应（棕黄色）特异准确地定位在凋亡的细胞。这种方法就是脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记法（TUNEL）。本实验参照TUNEL试剂盒说明进行操作,主要步骤如下:石蜡切片经二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水,PBS（0.01M,pH7.4）漂洗后,与阻断剂（0.3%H2O2甲醇溶液）室温孵育30min,PBS洗片,与通透液（0.1%TritonX-100溶于0.1%枸橼酸钠溶液中）在冰浴中孵育2分钟,PBS洗片2次,擦干样品周围的水,滴加50μl的TUNEL反应混合液,在湿盒中37℃孵育30分钟。PBS洗片3次,加入50-100μlDAB底物溶液,室温孵育10分钟,PBS洗片3次,封片。同时做阳性对照,（标本先用DnaseⅠ处理）和阴性对照（用无末端转移酶的标记液代替TUNEL反应混合液）,封片和观察。免疫组织化学ABC法检测Bcl-2、Bax表达:主要步骤:（1）石蜡切片经二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水,PBS漂洗5 min×2次;（2）3%的双氧水甲醇溶液室温孵育510 min,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS洗涤3次;（3）热修复抗原:将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）,微波炉加热至沸腾后断电,间隔5-10 min,反复1-2次,冷却后PBS洗涤2次（3）滴加5%正常山羊血清封闭,室温孵育20 min。倾去多余液体;（4）滴加Bcl-2和BaxⅠ抗（1:100稀释）湿盒孵育,4℃冰箱内过夜,PBS洗涤5 min×2次;（5）滴加生物素标记的二抗工作液,37℃孵育45 min,PBS洗涤5 min×2次;（6）滴加试剂SABC（1:100稀释）, 37℃孵育20 min,PBS洗涤5 min×2次;（7）DAB显色515 min,终止呈色反应;（8）苏木素衬染,常规裱片、干燥、脱水、透明、封片。结果判定及图象处理:光学显微镜下,凋亡细胞核呈棕黄色,Bcl-2蛋白和Bax蛋白染色呈棕黄色颗粒,每张切片高倍镜下（×400）由同一观察者选取支气管四周及左上共5个视野,计算机图象处理软件半定量测定细胞凋亡指数及Bcl-2、Bax含量（以染色吸光度值表示）。3.7咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织MMP-9mRNA表达的影响动物分组、模型建立、用药情况及数据统计处理同前。动物完全麻醉后,开胸迅速结扎左主支气管,取左肺,称取50-100mg移入玻璃匀浆器中,加入1mlTrizol充分匀浆,采用RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中MMP-9mRNA表达的变化。4.统计学方法:数据采用均数±标准差（x±S）表示,用STATA统计软件处理,统计方法采用单因素方差分析及q检验。显著差异水平以0.05和0.01为标准。结果1咳喘宁对支气管哮喘大鼠支气管-肺组织病理学、气管壁形态及支气管-肺组织Ⅲ型胶原含量的影响1.1哮喘大鼠支气管-肺组织病理学正常组:大鼠支气管内及其周围无明显炎性细胞浸润,支气管壁完整,平滑肌厚度正常,细胞排列规整,支气管粘膜规整,管腔内无脱落上皮细胞。模型组:支气管壁及其周围肺组织中有大量噬酸性粒细胞及淋巴细胞为主的炎性细胞浸润,基层细胞增生,平滑肌增厚,排列紊乱,支气管粘膜水肿增厚,上皮脱落,微血管渗漏,管腔内分泌物增多。咳喘宁高剂量组:支气管周围噬酸性粒细胞及其他炎性细胞浸润明显减少,几乎消失,管壁和平滑肌厚度接近正常组,支气管粘膜规整,管腔内偶见脱落上皮细胞及粘液。咳喘宁低剂量组:支气管周围噬酸性粒细胞及其他炎性细胞浸润略微减少,管壁和平滑肌厚度略减少,管腔内偶见脱落上皮细胞及黏液。桂龙咳喘宁组:支气管周围噬酸性粒细胞及其他炎性细胞浸润略微减少,气管壁和平滑肌厚度减少,支气管腔内少量脱落细胞和粘液。1.2大鼠支气管壁面积及支气管平滑肌面积与正常组相比,模型组大鼠支气管壁面积及支气管平滑肌面积明显增加,二者差异具有显著性意义﹙p<0.01﹚;与模型组比较,各治疗组支气管壁面积及支气管平滑肌面积均降低,咳喘宁高剂量组降低最明显﹙p<0.01﹚,其次为咳喘宁低剂量组﹙p<0.01﹚、桂龙咳喘宁组（p<0.01）;与桂龙咳喘宁组对比,咳喘宁高剂量及低剂量组支气管壁面积及支气管平滑肌面积减低,二者差异具有显著意义﹙p<0.01或p<0.05﹚1.3大鼠支气管-肺组织中Ⅲ型胶原含量与正常组相比较,模型组大鼠支气管-肺组织中Ⅲ型胶原含量明显升高,差异具有显著性意义﹙p<0.01﹚;与模型组比较,各治疗组Ⅲ型胶原含量均降低,咳喘宁高剂量组降低最明显﹙p<0.05﹚,其次为咳喘宁低剂量组﹙p<0.05﹚、桂龙咳喘宁组;与桂龙咳喘宁组对比,咳喘宁高剂量组Ⅲ型胶原含量低,二者差异具有显著意义﹙p<0.05﹚。2咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）的影响。与正常组相比,模型组大鼠MMP-9含量明显升高,差异具有显著性意义﹙p<0.01﹚;与模型组比较,各治疗组MMP-9含量均降低,咳喘宁高计量组降低最明显﹙p<0.01﹚,其次为咳喘宁低剂量组、桂龙咳喘宁组;与桂龙咳喘宁组对比,咳喘宁高剂量组MMP-9含量低,二者差异具有显著意义﹙p<0.05﹚。与正常组相比,模型组大鼠TIMP-1含量明显升高,差异具有显著性意义﹙p<0.01﹚;与模型组比较,各治疗组TIMP-1含量均降低,咳喘宁高计量组降低最明显﹙p<0.05﹚,其次为咳喘宁低剂量组、桂龙咳喘宁组;与桂龙咳喘宁组对比,咳喘宁高剂量组TIMP-1含量低,二者差异具有显著意义﹙p<0.05﹚。与正常组相比,模型组MMP-9/ TIMP-1比值明显升高,其差异具有显著意义﹙p<0.01﹚;与模型组比较,各治疗组MMP-9/ TIMP-1比值均下降其中咳喘宁高剂量组降低最明显﹙p<0.01﹚,其次为咳喘宁低剂量组﹙p<0.01﹚、桂龙咳喘宁组;与桂龙咳喘宁组对比,咳喘宁高剂量组MMP-9/TIMP-1比值低,二者差异具有显著意义﹙p<0.05﹚。3咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）的影响与正常组相比,模型组大鼠ET-1及NO含量明显升高,差异具有显著性意义﹙p<0.01﹚;与模型组比较,各治疗组ET-1及NO含量均降低,咳喘宁高剂量组降低最明显﹙p<0.05﹚,其次为咳喘宁低剂量组、桂龙咳喘宁组;与桂龙咳喘宁组对比,咳喘宁高剂量组ET-1及NO含量低,二者差异具有显著意义﹙p<0.05﹚。4咳喘宁对支气管哮喘大鼠支气管-肺组织转化生长因子（TGF-β1）,血管内皮生长因子（VEGF）的影响与正常组相比,模型组大鼠TGF-β1及VEGF含量明显升高,差异具有显著性意义﹙p<0.01﹚;与模型组比较,各治疗组TGF-β1及VEGF含量均降低,咳喘宁高剂量组降低最明显﹙p<0.05﹚,其次为咳喘宁低剂量组、桂龙咳喘宁组;与桂龙咳喘宁组对比,咳喘宁高剂量组TGF-β1及VEGF含量低,二者差异具有显著意义﹙p<0.05﹚。5咳喘宁对支气管哮喘大鼠支气管及周围组织中细胞凋亡指数及相关基因蛋白Bcl-2、Bax表达的影响。各组中正常组大鼠支气管壁及其周围肺组织细胞凋亡指数最低,与正常组相比,模型组大鼠的支气管壁-肺组织细胞凋亡指数显著增加（p <0.01 ）,与模型组相比,各个治疗组大鼠肺组织及支气管壁周围凋亡细胞数明显增加,凋亡指数显高于模型组,与桂龙咳喘宁组相比,咳喘宁高剂量组凋亡指数升高最为明显,二者差异具有显著意义（p <0.01 ）。各组中正常组Bcl-2含量最低,主要分布于支气管上皮细胞中,与正常组相比,模型组大鼠支气管上皮细胞中Bcl-2含量明显升高,差异具有显著性意义﹙p<0.01﹚;与模型组比较,各治疗组支气管上皮细胞中Bcl-2含量均升高,咳喘宁高剂量组升高最明显﹙p<0.01﹚,其次为桂龙咳喘宁组﹙p<0.01﹚、咳喘宁低剂量组﹙p<0.01﹚;与桂龙咳喘宁组对比,咳喘宁高剂量组Bcl-2含量高,二者差异具有显著意义﹙p<0.05﹚。各组中正常组Bax含量最低,主要分布于气道壁及气道周围组织中,与正常组相比,模型组大鼠Bax含量明显升高,差异具有显著性意义﹙p<0.01﹚;与模型组比较,各治疗组Bax含量均升高,咳喘宁高计量组升高最明显﹙p<0.01﹚,其次为咳喘宁低剂量组﹙p<0.01﹚、桂龙咳喘宁组﹙p<0.01﹚;与桂龙咳喘宁组对比,咳喘宁高、低剂量组Bax含量均升高,差异具有显著意义﹙p<0.01﹚。6咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织MMP-9mRNA表达的影响与正常组相比,模型组大鼠MMP-9mRNA含量明显升高,差异具有显著性意义﹙p<0.01﹚;与模型组比较,各治疗组MMP-9mRNA含量均降低,咳喘宁高计量组降低最明显﹙p<0.05﹚,其次为咳喘宁低剂量组、桂龙咳喘宁组;与桂龙咳喘宁组对比,咳喘宁高剂量组MMP-9mRNA含量低,二者差异具有显著意义﹙p<0.05﹚。结论1咳喘宁能有效地降低支气管哮喘大鼠支气管壁和平滑肌厚度,减轻支气管周围EOS及其他炎性细胞浸润,减轻支气管上皮脱落。2咳喘宁能有效降低支气管哮喘大鼠肺组织中Ⅲ型胶原含量,抑制细胞外基质沉积,从而对抗气道重塑。3咳喘宁降低支气管哮喘大鼠肺组织中Ⅲ型胶原含量、抑制细胞外基质沉积的作用可能与其降低肺组织中转化生长因子,表皮生长因子含量相关。4咳喘宁降低支气管哮喘大鼠肺组织中Ⅲ型胶原含量、抑制细胞外基质沉积的作用可能与其降低肺组织中MMP-9含量,提高TIMP-1含量,降低MMP-9/TIMP-1比例相关。5咳喘宁降低支气管哮喘大鼠肺组织中Ⅲ型胶原含量、抑制细胞外基质沉积的作用可能与其降低肺组织中一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）的含量相关。6咳喘宁降低支气管哮喘大鼠肺组织中Ⅲ型胶原含量、抑制细胞外基质沉积的作用可能与其提高肺组织中bcl-2、bax基因表达使组织中Bcl-2、Bax蛋白含量增加,导致支气管壁及其周围组织细胞凋亡有关。7咳喘宁降低支气管哮喘大鼠肺组织中Ⅲ型胶原含量、抑制细胞外基质沉积的作用可能与其抑制肺组织中MMP-9mRNA的表达,从基因转录水平降低MMP-9含量,从而抑制气道重塑。