乳铁蛋白抗菌肽的制备及分离纯化

论文摘要

乳铁蛋白是牛初乳中的一种生物活性蛋白,具有广谱抗菌、增强铁的传递与吸收、免疫调节、抗病毒等作用,但是其热稳定性很差,限制了其应用范围。将其酶解不仅可以提高抑菌活性,还可以增强热稳定性,这将拓宽它在食品、医药、饲料等行业的应用。本课题对天然抗菌剂的开发具有重要意义。本论文主要研究了制备乳铁蛋白抗菌肽的酶解工艺、脱盐工艺和分离纯化,并对此抗菌肽进行了抑菌性研究。首先,研究了乳铁蛋白抗菌肽的酶解工艺。通过单因素试验,响应面回归分析得到酶解的最佳工艺为:采用胃蛋白酶为酶源,乳铁蛋白浓度为30 mg/mL,胃蛋白酶与乳铁蛋白的质量比为1.5%,温度44℃,pH 2.4,水解时间2 h。优化条件下水解度为10.76%,抑菌率为97.97%。乳铁蛋白抗菌肽氨基酸组成分析显示,其中疏水性氨基酸占32.90%,碱性氨基酸占19.15%。高效液相体积排阻分析发现,乳铁蛋白抗菌肽的相对分子质量主要分布在2006000左右。其次,研究了DA201-C大孔吸附树脂对乳铁蛋白抗菌肽静态及动态脱盐作用。通过静态吸附实验,得到了吸附的动力学曲线及方程、吸附等温线和最佳洗脱剂。对于上样浓度为10 mg/mL的乳铁蛋白抗菌肽,吸附速率方程为Y=0.5035X-0.3971（R2=0.9045）;上样浓度为30 mg/mL时,吸附速率方程为Y=0.4887X+1.0815（R2=0.9412）。平衡吸附量方程为:Qe =1.7461C +0.5703（R2=0.9993）。最佳的洗脱剂为85%乙醇。动态吸附实验结果表明:在采用85%乙醇为洗脱剂时,DA201-C大孔吸附树脂对乳铁蛋白抗菌肽的脱盐率为97.40%,乳铁蛋白抗菌肽的回收率为92.54%。对乳铁蛋白抗菌肽的稳定性研究发现,其具有较强的耐肠道酶消化稳定性;在酸性条件下,具有较强的热稳定性和贮藏稳定性。最后,研究了乳铁蛋白抗菌肽的分离纯化。首先通过Sephadex G-50分离得到了抗菌性更强的乳铁蛋白抗菌肽-b,该肽在1 mg/mL时,对大肠杆菌的抑菌率为99.17%。然后通过半制备RP-HPLC进一步分离得到的乳铁蛋白抗菌肽-b1,它在0.1 mg/mL时对大肠杆菌的抑菌率为99.05%。进一步通过分析型RP-HPLC纯化,得到了乳铁蛋白抗菌肽-b1-1,图谱显示为单一峰。在0.1 mg/mL时对大肠杆菌的抑菌率为99.12%,其相对分子质量为2500左右。研究结果还表明,该抗菌肽可以抑制包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌等常见的食品腐败菌及致病菌,具有广谱抗菌性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 生物活性肽
• 1.2 抗菌肽
• 1.2.1 抗菌肽的分类与结构
• 1.2.2 抗菌肽的抗菌机理
• 1.2.3 抗菌肽的研究开发现状
• 1.2.4 抗菌肽研究面临的问题
• 1.3 乳铁蛋白
• 1.3.1 乳铁蛋白的结构
• 1.3.2 乳铁蛋白的生物活性及应用展望
• 1.4 乳铁蛋白抗菌肽的研究现状
• 1.5 立题背景和意义
• 1.6 论文的主要研究内容
• 第二章 乳铁蛋白酶解工艺
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料和设备
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 乳铁蛋白酶解工艺
• 2.3.2 蛋白酶活力测定
• 2.3.3 蛋白质水解度的测定
• 2.3.4 大肠杆菌菌浓-吸光度标准曲线
• 2.3.5 抑菌性的测定
• 2.3.6 氨基酸组成分析
• 2.3.7 相对分子量分布的测定
• 2.3.8 数据统计及分析
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 不同蛋白酶对乳铁蛋白的酶解能力
• 2.4.2 酶源对制备乳铁蛋白抗菌肽的影响
• 2.4.3 温度对水解度的影响
• 2.4.4 底物浓度对水解度的影响
• 2.4.5 酶与底物浓度比对水解度的影响
• 2.4.6 pH 对水解度的影响
• 2.4.7 工艺优化
• 2.4.8 优化条件下的水解进程曲线及其抑菌性
• 2.4.9 乳铁蛋白及其酶解产物中的氨基酸分析
• 2.4.10 乳铁蛋白酶解产物的相对分子量分布
• 2.5 本章小结
• 第三章 乳铁蛋白抗菌肽的脱盐工艺
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料和设备
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 乳铁蛋白抗菌肽的制备
• 3.3.2 大孔吸附树脂的预处理
• 3.3.3 大孔吸附树脂的静态吸附试验
• 3.3.4 多肽浓度的测定
• 3.3.5 大孔吸附树脂的静态吸附动力学分析
• 3.3.6 大孔吸附树脂的静态吸附等温线
• 3.3.7 大孔吸附树脂的静态解吸试验
• 3.3.8 大孔吸附树脂的动态解吸试验
• 3.3.9 抑菌性的测定
• 3.3.10 灰份的测定
• 3.3.11 乳铁蛋白抗菌肽的稳定性的测定
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 大孔吸附树脂的选择
• 3.4.2 DA-201C 大孔吸附树脂吸附前后吸收光谱变化
• 3.4.3 DA201-C 大孔吸附树脂的吸附动力学特征
• 3.4.4 DA201-C 大孔吸附树脂的平衡吸附量
• 3.4.5 乳铁蛋白抗菌肽的静态解吸
• 3.4.6 乳铁蛋白抗菌肽的动态脱盐
• 3.4.7 乳铁蛋白抗菌肽的稳定性
• 3.5 本章小结
• 第四章 乳铁蛋白抗菌肽的分离纯化
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料与设备
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 脱盐乳铁蛋白抗菌肽的制备
• 4.3.2 抑菌性的测定
• 4.3.3 乳铁蛋白抗菌肽的凝胶过滤色谱分离
• 4.3.4 半制备RP-HPLC 分离乳铁蛋白抗菌肽
• 4.3.5 分析型RP-HPLC 纯化乳铁蛋白抗菌肽
• 4.3.6 相对分子质量的测定
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 乳铁蛋白抗菌肽的凝胶过滤色谱分离
• 4.4.2 经凝胶色谱分离后不同组分对大肠杆菌的抑制活性
• 4.4.3 半制备RP-HPLC 分离乳铁蛋白抗菌肽-b
• 4.4.4 分析型RP-HPLC 纯化乳铁蛋白抗菌肽-b1
• 4.4.5 乳铁蛋白抗菌肽的抑菌活性的研究
• 4.5 本章小结
• 致谢
• 参考文献
• 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文