植酸酶产酶条件及其基因克隆表达研究

论文摘要

植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇和磷酸及磷酸盐的一类酶,能释放被植酸络合的矿物元素和一些蛋白质。植酸酶可以解除植酸的抗营养作用,在饲料、食品、医药等领域有着广泛的应用前景。本实验成功筛选出了一株高产、稳定的产植酸酶菌株,初步鉴定为黑曲霉,并命名为A.nigerFZ56。摸索了液体发酵产酶的最佳条件,获得其最适发酵培养基（w/w）:可溶性淀粉4%,NH4NO30.08%,KCl0.05%,MgSO4·H2O0.05%,FeSO4·7H2O0.003%,MnSO4·7H2O0.003%,水1 L。培养基起始pH值6.0,种龄为36 h,接种量为5%,装液量为50/500 mL,在30℃、220 r/min下培养84 h,酶活可达到221U/mL。从A.niger FZ56液态发酵产物中提取植酸酶。粗酶液经硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换层析纯化后,提纯倍数可达10.3,回收率为25.2%。酶学性质研究表明,植酸酶最适作用温度为55℃、最适作用pH为6.0,米氏常数Km为0.14mmol/L。通过PCR从A.nigerFZ56基因组中扩增出植酸酶phy A基因,将其转入毕赤酵母GS-115中,整合到酵母染色体上并进行诱导表达,并对表达条件进行了优化。再用蛋白质分离纯化技术纯化重组酶并进行SDS-PAGE鉴定,蛋白质分子量约为61kDa,而植酸酶基因产物的理论值为50kDa,说明有一定程度的糖基化。最后测定了表达产物的酶学性质,结果表明表达产物的最适pH为6.0,最适温度为55℃,与前面结果一致,说明植酸酶在毕赤酵母GS-115得到预期的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 植酸酶
• 1.1.1 植酸酶分类
• 1.1.2 植酸酶来源
• 1.1.3 植酸酶作用机理
• 1.1.4 植酸酶的理化特征
• 1.2 植酸酶高产菌株的选育
• 1.2.1 分离产酶天然菌株
• 1.2.2 通过诱变改造天然菌株
• 1.3 植酸酶的检测方法
• 1.3.1 钒-钼酸铵法
• 1.3.2 Vc-钼蓝法
• 4-钼蓝法'>1.3.3 FeSO₄-钼蓝法
• 1.3.4 丙酮-酸钼铵法
• 1.4 植酸酶的分离纯化
• 1.4.1 硫酸铵沉淀及脱盐
• 1.4.2 SephadexG-100分离
• 1.4.3 DEAE52-cellulose离子交换层析
• 1.5 植酸酶基因工程
• 1.5.1 植酸酶基因在微生物中表达
• 1.5.2 植酸酶基因在植物中表达
• 1.6 植酸酶的应用
• 1.6.1 植酸酶在食品工业的应用
• 1.6.2 植酸酶在饲料工业的应用
• 1.6.3 生产肌醇磷酸盐或肌醇
• 1.6.4 农业生产
• 1.7 目前植酸酶的研究热点
• 1.8 本试验的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要化学药品及试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 产植酸酶菌株的筛选
• 2.2.2 产植酸酶菌株的初步鉴定
• 2.2.3 植酸酶活力的测定
• 2.2.4 培养基对产酶的影响
• 2.2.5 培养条件对产酶的影响
• 2.2.6 植酸酶的分离纯化
• 2.2.7 植酸酶性质的测定
• 2.2.8 植酸酶phy A基因在毕赤酵母GS-115系统中的表达
• 3 结果与分析
• 3.1 植酸酶产生菌的筛选结果
• 3.2 标准磷曲线的绘制
• 3.3 培养基条件对产酶的影响
• 3.3.1 不同碳源对产酶的影响
• 3.3.2 不同氮源对产酶的影响
• 3.3.3 无机元素对产酶的影响
• 3.3.4 正交试验
• 3.3.5 培养基起始pH对产酶的影响
• 3.4 培养条件对产酶的影响
• 3.4.1 发酵温度对产酶的影响
• 3.4.2 培养时间对产酶的影响
• 3.4.3 种子菌龄对产酶的影响
• 3.4.4 培养基接种量对产酶的影响
• 3.4.5 三角瓶装液量对产酶的影响
• 3.4.6 遗传稳定性试验
• 3.5 植酸酶的分离纯化
• 2对酶提取的影响'>3.5.1 不同浓度CaCl₂对酶提取的影响
• 3.5.2 提取次数与酶的得率的关系
• 3.5.3 植酸酶纯化结果
• 3.6 植酸酶性质的测定
• 3.6.1 植酸酶最适反应温度
• 3.6.2 植酸酶的热稳定性
• 3.6.3 植酸酶的最适反应pH
• 3.6.4 植酸酶的pH稳定性
• 3.6.5 干燥酶耐高温实验
• 3.6.6 植酸酶米氏常数（Km）的测定
• 3.7 植酸酶PHY A基因在毕赤酵母GS-115系统中的表达
• 3.7.1 phy A基因PCR扩增结果
• 3.7.2 phy A基因的克隆及重组质粒的鉴定
• 3.7.3 重组酵母的转化和筛选鉴定
• 3.7.4 重组酵母诱导表达条件的优化
• 3.7.5 重组植酸酶的纯化和SDS-PAGE的鉴定
• 3.7.6 重组植酸酶与之前分离纯化的植酸酶酶学性质的比较
• 4 讨论
• 4.1 植酸酶产生菌的筛选方法
• 4.2 植酸酶活力测定方法
• 4.3 培养基和发酵条件的优化
• 4.4 植酸酶的分离纯化和酶学性质测定
• 4.5 植酸酶基因克隆表达研究
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录