异种表皮生长因子受体胞外段的表达及其抗肿瘤效果研究

论文摘要

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）是ErbB家族成员之一,具有酪氨酸激酶活性,是一种重要的跨膜受体。该家族成员还包括HER2/erbB2,HER3/ erbB3,HER4/erbB4。表皮生长因子受体由胞外段,跨膜区和胞内激酶活性区构成。其胞外区的主要功能是结合表皮生长因子EGF等配体激活受体胞内段酪氨酸激酶活性,启动信号传导通路,在正常组织及肿瘤组织中起到调节细胞增殖、分化的作用。EGFR在肿瘤进展过程中发挥了重要的作用,它能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移、抑制凋亡以及促进肿瘤组织的血管生成等[1,2]。临床研究显示,肿瘤的恶化、患者的低生存率以及对药物的低敏感性与肿瘤细胞胞表达EGFR分子成正相关[3]。近年来,随着癌症检测手段的发展,在很多癌症包括前列腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌等患者中检测到了EGFR的异常高水平的表达[1,2,4]。因此,EGFR成为肿瘤靶向研究的热点。两个研究比较成功的例子是单克隆抗体和小分子酪氨酸抑制剂（TKI）。其中单克隆抗体方面的Cetuximab、panitumumab, TKI方面的Tarceva（Erlotinib）、Iressa（Gefitinib）等已经被FDA批准用于临床的癌症治疗。这两方面的成功提示我们,靶向EGFR的治疗策略是可行的,并将在癌症治疗领域发挥巨大作用。在本研究中,我们试图通过对小鼠免疫异种EGFR蛋白,使小鼠产生抗EGFR的抗体,来阻断EGFR信号通路,从而达到抗肿瘤效果。根据GenBank发表的鸡源EGFR基因序列,我们设计了一对特异性核苷酸引物,用PCR方法获得鸡源EGFR胞外部分642bp大小的基因片段,并将其克隆到表达载体pGEX-4T-2上,测序鉴定正确后,转化到表达菌株BL21（DE3）中,经PCR鉴定和酶切鉴定筛选出阳性克隆,IPTG诱导,并进一步通过Ni-NTA Agarose亲合层析纯化目的蛋白,纯化产物以SDS-PAGE鉴定。纯化产物经透析复性,Western blot鉴定其抗原性,得到用于免疫的GST-cEGFR融合蛋白。将14只C57BL16J小鼠随机分为2组,GST-cEGFR实验组7只、生理盐水对照组（NS）7只,实验组和对照小鼠每只分别于第0,2,3周注射100μgGST-cEGFR融合蛋白和100μL生理盐水。接种Lewis肺癌细胞,观察肿瘤的生长情况和小鼠状态并检测小鼠血清中特异性抗EGFR抗体滴度。实验中成功克隆了包含642bp的鸡源EGFR基因,构建了原核表达重组质粒pGEX4T2-cEGFR。cEGFR-GST融合蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达,经Ni-NTA Agarose纯化后得到纯度达85%以上的重组融合蛋白。经复性,融合蛋白以可溶的形式存在,Western blot鉴定该融合蛋白具有抗原性。动物实验结果表明,GST-cEGFR疫苗组小鼠血清的抗EGFR抗体滴度为1∶5000,并对小鼠肿瘤生长有一定的抑制效应。本研究表明,通过基因工程方法制备出的异种重组EGFR蛋白,可在小鼠体内诱导出抗EGFR抗体,成功的打破了小鼠的免疫耐受,有一定的抗肿瘤效应。这种异种蛋白疫苗策略在肿瘤主动免疫治疗领域将会有良好的发展前景。本研究表明,通过基因工程方法制备出的异种重组EGFR蛋白,可在小鼠体内诱导出抗EGFR抗体,成功的打破了小鼠的免疫耐受,有一定的抗肿瘤效应。这种异种蛋白疫苗策略,是一种有效的特异性主动免疫方法,在肿瘤主动免疫治疗领域将会有良好的发展前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 表皮生长因子及其受体酪氨酸激酶系统
• 1.1. EGF 及其受体系统
• 1.2. EGFR 的活化与信号传导
• 1.3. EGFR 作为肿瘤治疗靶点的机理
• 1.3.1 EGFR 在正常组织中的分布和功能
• 1.3.2 EGFR 在肿瘤中的过度表达与突变
• 第二章 靶向EGFR 治疗进展
• 2.1 HER 家族抗体研究进展
• 2.2 小分子酪氨酸抑制剂研究进展
• 2.3 EGFR 疫苗研究进展
• 试验研究
• 第三章 CEGFR 胞外段基因克隆及表达
• 3.1 材料、试剂与仪器
• 3.1.1 质粒和菌株
• 3.1.2 酶和试剂
• 3.1.3 培养基及主要试剂的配制
• 3.1.4 主要仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 目的基因的克隆
• 3.2.2 原核重组质粒pGEX-4T-2-cEGFR 的构建
• 3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 3.2.4 阳性克隆的筛选及重组表达载体的鉴定
• 3.2.5 cEGFR 胞外段的表达及纯化
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 cEGFR 基因的克隆及重组质粒的鉴定
• 3.3.2 测序鉴定
• 3.3.3 表达产物的SDS-PAGE 分析
• 3.3.4 表达产物的纯化
• 3.3.5 表达产物的Western blot 分析
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 肿瘤动物模型的建立及重组融合蛋白抗肿瘤效果的观察
• 4.1 材料、试剂与仪器
• 4.1.1 细胞株与实验动物
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 主要试剂的配制
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 融合蛋白疫苗免疫实验动物
• 4.2.2 Lewis 肺癌动物模型的建立
• 4.2.3 ELISA 法测定抗体的效价
• 4.2.4 肿瘤生长曲线的绘制
• 4.2.5 统计学分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 ELISA 法检测抗体效价
• 4.3.2 肿瘤体积的绘制
• 4.3.3 安全性观察
• 4.4 讨论
• 4.5 结论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介