极端超微细菌蛋白多糖对动物免疫功能调节的研究

论文摘要

多糖广泛存在于植物、动物和微生物细胞壁和细胞中，是构成生命的三大基本物质之一，也是具有免疫调节活性的生物大分子物质。本项目研究了超微细菌Glaciecola polaris蛋白多糖（PSK）的常规水浸提法中不同料液比、提取温度和时间对多糖得率、粘度和表面张力的影响；同时研究了超声提取对多糖得率、粘度和表面张力的影响。结果表明：提取时间对多糖的提取率存在显著的影响（p＜0.05），用水溶剂浸提细菌多糖，料水比1：15，提取温度在100℃左右，提取4h—6h，可获得较高的多糖得率，最高的得率可达8.08％，同时提取液粘度和表面张力较低。超声提取能提高PSK的得率，缩短提取时间，降低提取液的粘度和表面张力，有利于降低多糖浓度极化对分离纯化过程的阻力，提高处理量。超声处理条件以选择10-15min、100W功率，提取4h为宜，最高的得率可达8.82％。从体内抑制试验和体外培养巨噬细胞的杀瘤试验对多糖的抑瘤作用进行了研究。体内抑瘤试验采用灌胃方式，计算抑瘤率和生命延长率。体外试验将巨噬细胞与肿瘤细胞共培养，测定NO浓度与细胞毒效应。培养上清液中一氧化氮（NO）浓度采用NO试剂盒检测，细胞毒效应通过MTT比色法检测。用黄嘌呤氧化酶法测定服用鳖组织浆大鼠脑、肝、血中的超氧化物歧化酶（SOD）含量。结果表明，超微细菌Glaciecola polaris的蛋白多糖和细菌菌体对机体肿瘤具有不同程度的抑制作用，且能有效地增强机体对肿瘤的抵抗性，延长生命期。从细胞毒效应来看，超微细菌Glaciecola polaris的蛋白多糖和细菌菌体能明显促使Mφ的活化，从而激发NO合成显著增高，细胞毒效应增强，促进巨噬细胞对病毒感染细胞的杀伤作用，但这种促Mφ的细胞毒作用随蛋白多糖浓度的变化呈现一定的变化，高浓度（100uL）要好于低浓度（50uL）；从细菌菌体中提取的蛋白多糖要好于细菌菌体本身。另外，Glaciecola polaris的蛋白多糖还可显著地提高SOD的活性，而增强机体的免疫能力。从PSK对受低密度脂蛋白（Ox-LDL）和叔丁基氢过氧化物（tbOOH）等氧化物胁迫的巨噬细胞抗氧化能力进行了体外研究。PSK可有效地保护巨噬细胞减轻氧化损伤，且巨噬细胞克隆刺激因子（M-CSF）也有相似的结果。经PSK处理或M-CSF处理的巨噬细胞的成活率极显著地高于未经处理的巨噬细胞（p＜0.01）。经PSK处理的巨噬细胞培养基能显著地提高巨噬细胞克隆刺激因子的分泌（p＜0.05），并能显著地增加M-CSF的mRNA的表达（p＜0.05）。由此推测，PSK能减轻Ox-LDL和tbOOH对巨噬细胞的氧化损伤的作用，是与促进巨噬细胞对M-CSF的表达，提高M-CSF的分泌量相关联。以水质pH为应激源，探讨超微细菌Glaciecola polaris的蛋白多糖对中华鳖免疫和抗应激能力的影响。结果表明，超微细菌Glaciecola polaris的蛋白多糖对中华鳖幼鳖血细胞吞噬率、血清溶菌活力和杀菌活力有明显促进作用（p＜0.01），并对应激引起的皮质醇有抑制作用。由此可见，超微细菌Glaciecola polaris的蛋白多糖的添加不仅对酸应激所致的内分泌功能的紊乱有调整作用，而且对酸应激所致的免疫功能低下有保护作用。研究了蛋白多糖对中华鳖生长性能及免疫功能的影响。选用平均体重50-60g的中华鳖幼鳖300只，随机分成10组，试验组在基础饲料中添加0.05％、0.1％的超微细菌Glaciecola polaris的蛋白多糖，或添加0.1％、0.5％的超微细菌菌体粉碎物，对照组以0.5％α-淀粉代替。饲养8周，测定生产性能、免疫器官指数和血清抗氧化性能。结果表明，各试验组的生长比率、免疫器官指数和血清超氧化物歧化酶（SOD）活性，都显著与极显著地高于对照组（P＜0.05-0.01），并随添加量的增加而增加。饲料系数各试验组显著地低于对照组（P＜0.05）。超微细菌和蛋白多糖的添加对血清溶菌酶活力的影响差异不显著（P＞0.05）。建议超微细菌Glaciecola polaris的蛋白多糖适宜添加量为0.05％。

论文目录

• 本研究的创新性
• 缩略语
• 表格一览表
• 图一览表
• 摘要 （中文）
• 摘要 （英文）
• 1 前言
• 2 文献综述
• 2.1 多糖对免疫功能的影响研究进展
• 2.1.1 多糖对免疫系统的作用
• 2.1.1.1 多糖对细胞免疫的作用
• 激活巨噬细胞
• 激活T细胞和B细胞
• 激活NK细胞
• 激活补体系统
• 2.1.1.2 体液免疫
• 2.1.1.3 细胞因子
• 促进白细胞介素（IL）的生成
• 促进干扰素（IFN）的生成
• 诱生肿瘤坏死因子（TNF）
• 2.1.1.4 第二信使水平
• 2.1.1.5 对其他细胞因子的影响
• 2.1.2 抗氧化作用
• 2.1.2.1 多糖的抗氧化及清除自由基作用
• 2.1.2.2 多糖的抗氧化作用机理
• 2.1.3 抗肿瘤作用
• 2.1.4 抗病毒作用
• 2.1.4.1 多糖抗病毒作用概况
• 2.1.4.2 多糖抗HIV活性的作用和机理
• 干扰细胞与HIVgp120结合
• 抑制HIV逆转录酶活性
• 作用于反式激活蛋白tat
• 增强免疫系统的功能，提高机体的免疫力
• 2.1.4.3 多糖在AIDS临床治疗中的应用
• 2.1.5 抗凝血作用
• 2.2 中华鳖的营养与免疫研究进展
• 2.2.1 中华鳖的免疫系统
• 2.2.1.1 免疫器官
• 胸腺
• 肾脏
• 脾脏
• 粘膜淋巴组织（MALT）
• 2.2.1.2 免疫细胞
• 2.2.2 中华鳖的免疫功能
• 2.2.2.1 细胞免疫
• 2.2.2.2 体液免疫
• 2.2.3 影响鳖免疫应答的主要因素
• 2.2.3.1 环境因素
• 2.2.3.2 免疫原的质量
• 2.2.3.3 营养水平与营养素
• 蛋白质原料
• 肉碱
• 其他
• 2.3 结语
• 3 研究与讨论
• 3.1 超微细菌Glaciecola蛋白多糖提取和超声强化方法的研究
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.1.1 实验原料与处理
• 3.1.1.2 常规的水浸提法
• 3.1.1.3 常规的水浸提法
• 3.1.1.4 多糖总量测定、指标及检验
• 3.1.2 结果
• 3.1.2.1 提取条件对多糖得率的影响
• 3.1.2.2 提取条件对多糖粘度的影响
• 3.1.2.3 提取条件对多糖表面张力的影响
• 3.1.3 讨论
• 3.1.3.1 水浸提法的适宜条件选择
• 3.1.3.2 超声作用对多糖提取率的影响
• 3.1.3.3 超声作用对提取液物理性质的影响
• 3.1.4 结论
• 3.2 超微细菌Glaciecola的蛋白多糖对鼠免疫功能影响
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.1.1 试验材料
• 3.2.1.2 方法
• 3.2.2 结果
• 3.2.2.1 抑瘤率
• 3.2.2.2 生命延长率
• 3.2.2.3 巨噬细胞的免疫效应
• 3.2.2.4 对NO合成的影响
• 3.2.2.5 对SOD活性的影响
• 3.2.3 讨论
• 3.3 超微细菌Glaciecola的蛋白多糖对巨噬细胞抗氧化能力的影响
• 3.3.1 材料与方法
• 3.3.1.1 材料
• 试剂
• 极端细菌菌体及蛋白多糖收集
• 小鼠腹腔巨噬细胞的分离
• 3.3.1.2 方法
• 巨噬细胞活性分析
• 巨噬细胞克隆刺激因子（M-CSF） 表达和活性分析
• 3.3.2 结果
• 3.3.2.1 PSK对Ox-LDL胁迫的巨噬细胞生存力的影响
• 3.3.2.2 PSK对tbOOH胁迫的巨噬细胞生存力的影响
• 3.3.2.3 rhM-CSF对用tbOOH胁迫的小鼠腹膜巨噬细胞生存力的影响
• 3.3.2.4 PSK处理对小鼠腹膜巨噬细胞M-CSF分泌的影响
• 3.3.2.5 PSK对巨噬细胞集落刺激因子的基因表达的影响
• 3.3.3 讨论
• 3.4 超微细菌Glaciecola的蛋白多糖对中华鳖抗酸应激能力的影响
• 3.4.1 材料与方法
• 3.4.1.1 实验动物和驯化
• 3.4.1.2 细菌多糖获得
• 3.4.1.3 实验设计
• 3.4.1.4 酵母菌液的制备
• 3.4.1.5 血细胞的体外培养及涂片、计数
• 3.4.1.6 血清溶菌活力的测定
• 3.4.1.7 血清杀菌活力的测定
• 3.4.1.8 血清中皮质醇含量的测定
• 3.4.2 结果
• 3.4.2.1 中华鳖幼鳖血细胞吞噬率的变化
• 3.4.2.2 中华鳖幼鳖血清溶菌活力的变化
• 3.4.2.3 中华鳖幼鳖血清杀菌活力的变化
• 3.4.2.4 中华鳖幼鳖血清皮质醇含量的变化
• 3.4.3 讨论
• 3.4.3.1 蛋白多糖对中华鳖幼鳖血细胞吞噬率的影响
• 3.4.3.2 蛋白多糖对中华鳖血清溶菌活力和杀菌活力的影响
• 3.4.3.3 蛋白多糖对中华鳖血清皮质醇含量的影响
• 3.5 蛋白多糖对中华鳖生长性能及免疫功能的影响
• 3.5.1 材料与方法
• 3.5.1.1 材料
• 3.5.1.2 方法
• 试验设计
• 生产性能指标测定
• 免疫器官指数测定
• 血清超氧化物岐化酶（SOD）活力测定
• 血清溶菌酶活力测定
• 数据处理
• 3.5.2 结果与分析
• 3.5.2.1 蛋白多糖对中华鳖生长性能的影响
• 3.5.2.2 蛋白多糖对中华鳖免疫器官指数的影响
• 3.5.2.3 血清超氧化物岐化酶（SOD）活力和溶菌酶活力
• 3.5.3 讨论
• 3.5.3.1 超微细菌多糖对中华鳖生长性能的影响
• 3.5.3.2 超微细菌多糖对中华鳖免疫器官指数的影响
• 3.5.3.3 超微细菌多糖对中华鳖血清抗氧化能力的影响
• 4 提示与展望
• 4.1 提示
• 4.2 展望
• 参考文献
• 附录A: 攻读博士学位期间发表或录用的论文
• 附录B: 作者简介
• 附录C: 致谢