论文摘要
背景与目的肝豆状核变性又称Wilson病（Wilson disease, WD） [MIM#277900],是一种常染色体隐性遗传的铜代谢缺陷病,其基本代谢缺陷是肝脏不能正常合成铜蓝蛋白和自胆汁中铜排出量减少,导致铜在体内各脏器和组织中沉积（以脑和肝脏为主）,从而引起一系列的临床表现。肝豆状核变性的临床表现形式多样,以进行性肝脏损害、神经精神系统功能障碍、角膜边缘有铜盐色素沉着环（Kayser-Fleischer ring, K-F环）为主。该病在全球的发病率大约为1/30000,携带者频率为1/90；在中国该病的发病率高达1/10000,报道的病例数居国内神经系统单基因遗传病的首位,占神经遗传门诊的10.14%。肝豆状核变性是目前少数几个用药物治疗效果较好的单基因遗传病之一,治疗的重点在于早诊断、早治疗。然而,由于肝豆状核变性患者的临床表现形式多样,且早期症状一般比较隐匿,而铜生化检查结果在患者、杂合子和正常人之间存在10%-25%的重叠,这些因素常导致疾病的延误诊断。因此,对肝豆状核变性患者,尤其是一些临床表现不典型的病例进行基因诊断,对提高患者的生活质量具有重要意义。作为肝豆状核变性唯一的致病基因,ATP7B基因于1993年定位并克隆于13q14.3,其cDNA编码一种由1465个氨基酸残基组成的P型铜转运ATP酶（即ATP7B）。ATP7B蛋白主要有三个功能区,包括6个铜离子结合区、P型ATP酶功能区和8个跨膜功能区。肝豆状核变性患者的突变形式多样,以复合杂合突变为主,只有少数纯合突变；以少数几个常见突变为主,伴有广泛的罕见突变。到目前为止,世界范围内报道的致病突变已经超过500种,其中100余种在中国人群中报道,这些突变主要累及ATP7B基因的P型ATP酶功能区。此外,ATP7B等位基因突变具有极大的遗传异质性,即不同国家、民族或地区的热点突变区和高频突变位点不同,如在欧美裔WD患者中,14号外显子的p.His1069Gln突变和18号外显子的p.Gly1266Lys突变最为常见；中国人8号外显子的p.Arg778Leu突变发生率最高,是亚洲WD患者的优势突变。因此,建立不同地区、不同民族的肝豆状核变性突变谱,有利于对肝豆患者尤其是一些症状前患者进行快速诊断。近年来发展起来的变性高效液相色谱（Denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC）技术已被证明是一种具有准确、高效、经济、高通量、半自动化等优点的用于检测已知突变和筛查未知突变的方法。DHPLC检测基因突变的原理是基于部分变性条件下,异源双链和同源双链在DNA解链特征上的差异,使得它们在色谱柱中保留的时间不同而得以区分。与以往的变异检测技术,如变性梯度凝胶电泳（Denatured Gradient Gel Electrophoresis, DGGE）、错配化学切割分析（Chemical Cleavage of Mismatch, CCM）、构象敏感性凝胶电泳（Conformation Sensitive Gel Electrophoresis, CSGE）、单链构象多态性分析（Single-Strand Conformation Polymorphisms, SSCP）等相比,DHPLC具有较高的敏感性和特异性,目前已广泛应用于遗传性疾病的突变筛查和分子诊断。基于DHPLC上述特点,本研究拟应用PCR/DHPLC技术结合DNA直接测序,对中国南方人群肝豆状核变性患者进行突变分析,建立我国南方人群肝豆状核变性的突变谱,从而为中国南方肝豆患者的遗传咨询、临床／产前诊断提供有用的信息。材料与方法收集了来自于70个无亲戚关系家庭的73例临床诊断为肝豆状核变性的患者及其家属样本共169例,均为我国南方地区汉族人群。肝豆状核变性的临床诊断依据包括以下2个方面：①典型的临床表现：角膜色素沉着环（K-F环）,急性或慢性肝脏损害,和/或震颤、肌僵直、构语障碍等锥体外系症状、体征；②常规的铜生化检查：血浆铜蓝蛋白水平降低（<0.2 g/L）,24小时尿铜排泄增加（>100μg/24h）。73例患者的发病年龄为3-48岁,其中男性41例（56.16%）,女性32例（43.84%）；以肝型为主要表现的患者有45例,以脑型为主要表现的患者27例,还有1例表现为混合型。此外,用来自于本实验室的200例中国汉族正常人样本作为对照研究。采用经典的酚/氯仿法提取所有样品的外周血基因组DNA,利用PCR反应扩增ATP7B基因全部编码序列及与外显子毗邻的剪接区域,用DHPLC技术直接对PCR产物进行筛选,出现异常峰的样本经DNA直接测序验证变异位点。结果与讨论应用DHPLC技术,通过对来自于70个无亲戚关系家庭的73例肝豆状核变性患者（共146条染色体）及其家属的ATP7B基因全部外显子进行突变筛查,我们共发现了50种异常色谱峰形,DNA直接测序发现这些异常峰形由38种致病突变和13种多态组成。DHPLC峰形具有较好的重复性,即在同一片段中,相同突变的不同样本的色谱峰形极为相似。本研究建立的基于PCR/DHPLC技术的肝豆状核变性未知突变筛查的分子诊断方法是一种快速、准确、高效、半自动化、高通量的突变检测技术,适用于遗传病的临床/产前诊断以及大规模的分子流行病学调查研究。本实验中检测的38种致病突变包括24种错义突变、3种剪接位点突变、5种无义突变以及6种移码突变。这些突变主要分布在外显子3、7、8、11、12、13和16。73例患者中,有31例检出2个致病突变,2例检出3个致病突变,36例患者仅检出一个突变以及4例未检出突变。总的染色体突变检出率为69.86%（102/146）,其中位于外显子8上的突变占总突变的38.46%（40/104）,居本研究突变检出率的第一位；外显子16上的突变占总突变的19.23%（20/104）,居第二位；外显子13上的突变占总突变的12.50%（13/104）,居第三位。这三个外显子上的突变覆盖了总突变的70.19%（73/104）。因此,在对中国南方肝豆状核变性患者进行分子诊断时,我们建议首先对外显子8、16和13进行突变筛查。73例患者中,我们仅发现了3例纯合子和30例复合杂合子,这说明肝豆状核变性患者以复合杂合突变为主；另外有36例患者仅筛出一个突变以及4例未检出突变,这意味着存在一些未知突变位于ATP7B基因编码序列外,如内含子区域、启动子、DNA序列其它调控区域等。这些结果进一步显示了肝豆状核变性具有极大的异质性,我们无法通过患者的基因型有效的推测表型。此外,我们对2例携带三个致病突变的患者进行了家系分析,结果显示两个先证者共有的两个突变——c.3443T>C和c.3426G>C,位于同一条染色体上,c.3426G>C对c.3443T>C具有顺式调控作用。这种现象先前仅在中国香港人群中报道,因此我们推测这种顺式调控机制是中国南方人群所特有的。本研究的第一突变热点是位于8号外显子的p.Arg778Leu突变,其等位基因检出率为23.29%（34/146）,这与其它关于中国人第一突变热点的研究报道一致。此外,我们通过比较p.Arg778Leu纯合子组和复合杂合子组的临床资料（包括发病年龄、血清铜水平和血浆铜蓝蛋白水平）来研究该热点突变对患者表型的影响。统计学结果显示两组患者发病年龄的差异具有统计学意义,纯合子组的发病年龄高于复合杂合子组（P=0.002）。这些结果显示p.Arg778Leu是一种温和突变,然而由于研究例数较少,更深入的探讨p.Arg778Leu突变对患者表型的影响有待于病例的积累以及蛋白表达功能的研究。本研究的第二突变热点为p.Ile1148Thr,位于16号外显子,其染色体检出率为9.59%（14/146）。欧美裔患者的第一突变热点p.His1069Gln在本研究中未检出。此外,我们还检测出了13种多态,包括2种新的同义突变——位于5号外显子的c.1839C＞T （p.Ile613Ile）突变和位于13号外显子的c.2922G>A （p.Thr974Thr）突变。在本实验中,我们还鉴定了10种新的致病突变,包括6种错义突变（c.2120A>G、c.2564C＞A、c.2620G>C、c.2761A>C、c.3236G>T和c.3446G>A）、2种剪接位点突变（c.2121+3A>T和c.3244-2A>G）、1种无义突变（c.3682A>T）以及1种移码突变（c.18751876insAATT）。在200例正常对照人群中没有发现这些突变,证实这10种为致病突变,而非多态。另外,通过在PubMed上进行文献检索,以及在肝豆状核变性突变网站（http://www.wilsondisease.med.ualberta.ca/database.asp）和人类突变数据库（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/validate.php）进行查询,我们发现这10种突变未曾报道,证实为新突变。这些新突变进一步扩展了中国人肝豆状核变性的突变范围,丰富了世界范围内ATP7B基因的突变谱。总的来说,本研究为肝豆状核变性建立了一种快速准确的分子诊断方法；通过对中国南方人群肝豆状核变性患者进行突变分析,建立了我国南方人群肝豆状核变性的突变谱。在已报道的突变基础上,发现了10种新致病突变以及2种新同义突变,进一步扩展了中国肝豆状核变性的突变范围,丰富了世界范围内肝豆状核变性的突变谱。这些研究结果对于进一步研究我国人群中WD的遗传特点、预防或早期诊断和治疗、提高患者的生活质量具有重要的医学意义和实用价值。