构建白血病免疫学分型细胞芯片的片基选择及最佳修饰方法的研究

论文摘要

目的随着大量抗白细胞表面分化抗原单克隆抗体的问世，应用其来检测白血病细胞表面分化抗原，以确定其细胞系列来源及发育阶段，推动了白血病免疫学分型的研究，提高了白血病诊断的准确性。目前常用的进行白血病免疫学分型的方法有免疫组化法、免疫荧光法，但这两种方法存在很多缺陷。前者不能同时进行多种抗原检测；检测一种抗原需要的单克隆抗体量较多，不经济；处理步骤多，费时。后者同时检测抗原种类有限；检测所需的荧光显微镜或流式细胞仪设备昂贵。对细胞高通量研究的要求与芯片技术的结合使细胞芯片应运而生，这种新型的检测技术平台的出现，克服了上述方法的缺陷，使白血病的免疫学分型高通量诊断更快捷、方便。本实验室构建的用于白血病免疫学分型的细胞芯片就是利用抗原、抗体特异性结合的原理，将白细胞表面分化抗原单克隆抗体固定于载体上，形成抗体点阵。不同的单克隆抗体能够自动识别和捕获表达相应表面分化抗原的细胞，从而对白血病进行免疫学分型。载体选择是芯片制备过程中的第一个关键步骤。选择何种载体及如何修饰才能使单克隆抗体更牢固、更特异性地固定在载体表面，同时使固相支持物表面的蛋白保持最大的活性，是影响该技术检测成功率的关键。本实验欲探索制备细胞芯片的最佳载体及载体的最佳修饰方法。方法1、制备5种片基分别对玻片进行氨基硅烷-醛基修饰、壳聚糖-氨基修饰、壳聚糖-醛基修饰、巯基修饰；聚苯乙烯板蒸馏水超声清洗备用。2、确定5种片基的最佳点样缓冲液pH值分别用含3％甘油的pH值为6.0、7.2、8.5的磷酸盐缓冲液和pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，1：4稀释CD单抗，在5种片基上点制抗体点阵，水化、封闭、清洗。取新鲜正常人的外周血2ml，用本实验室自配的全白细胞分离液提取白细胞（>1×106/ml），丫叮橙染色、清洗，孵育芯片45分钟，PBS清洗至背景干净，扫描，分析不同片基的最佳点样缓冲液pH值。3、确定5种片基固定抗体的饱和浓度将原浓度是200μg/ml的CD单抗分别按1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64稀释后，在5种片基上按浓度下降的次序点样，FITC标记的羊抗鼠IgG溶液（浓度100μg/ml）孵育30分钟，分析不同片基固定抗体的饱和浓度。4、确定5种片基固定抗体的最佳时间在5种片基上固定CD单抗，分别在湿盒中4℃水化0.5、1、2、4、12、24、48小时，FITC标记IgG溶液孵育，分析不同片基固定抗体的最佳时间。5、检测5种片基的蛋白结合力在5种片基上固定FITC标记的荧光抗体，比较不同片基的平均荧光信号强度及不同部位荧光信号强度的变异率。6、检测5种片基固定的蛋白活性及保存时间对蛋白活性的影响在芯片制备后1天、1个月、3个月和6个月，分别用荧光标记抗体和荧光标记细胞来检测蛋白的活性。结果1、不同方法修饰的玻片和聚苯乙烯片基分别在点样缓冲液pH值为7.2、9.6时，蛋白固定效果最好。2、抗体稀释比例达到1：4时，即抗体浓度达到50μg/ml时，5种片基固定的抗体均达到饱和浓度。3、在湿盒中4℃条件下固定时间超过12小时，蛋白的固定效果最好。4、氨基硅烷-醛基玻片蛋白固定效率最高，均匀度好，不同部位的荧光信号强度变异率<5％。5、氨基硅烷-醛基玻片固定的抗体活性最高，随着保存时间的延长抗体活性衰减最慢，保存6个月时仅有轻微的衰减。结论氨基硅烷-醛基玻片在以pH值为7.2的磷酸盐缓冲液作为点样缓冲液，固定蛋白的浓度为50μg/ml，固定时间大于12小时的条件下，对蛋白的固定效率及固定蛋白的反应性最好，且明显优于其他片基，可做为制备白血病免疫学分型细胞芯片的最佳载体。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 四、本研究的创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 致谢
• 个人简介