（1黑龙江省医院急诊科,2黑龙江省医院神经内科
3黑龙江省第二医院）
基金项目：黑龙江省卫生厅资助项目(No:2011650)
通讯作者：高宇飞E-mail:gaoyufei2@126.com
摘要
目的:观察阿托伐他汀对左肺切除复合野百合碱诱导肺动脉高压(PAH)大鼠的干预作用，并探讨其可能机制。
方法:将健康雄性Winster大鼠，随机分三组：1模型组,左肺切除7天后皮下注射野百合碱（50mg／kg)；2对照组，假手术处理并颈背部一次性皮下注射生理盐水5mL/kg。3治疗组,左肺切除的同时，阿托伐他汀组大鼠通过灌胃接受阿托伐他汀20mg/(kg.d)。在给予MCT后的7、14、21、28天，观测：血流动力学检测：平均右室压(mRVP)、平均肺动脉压(mPAP)，计算右室/左室+室间隔的比率（RVHI）；HE染色观察肺血管重构程度；Westernblot检测p-smad2的磷酸化水平。
结果：与对照组比较，模型组平均右室压、平均肺动脉压、右心指数明显升高(P<0.01);肺小动脉中膜明显增厚、管腔狭窄;Smad2的磷酸化水平在注射野百合碱左肺切除后7、14、21、28天明显上调，具时间依赖性(P<0.01)。与模型组相比，治疗组大鼠平均右室压、平均肺动脉压、右心指数降低(P＜0．05);Smad2的磷酸化水下调(P＜0．05)。
结论：阿托伐他汀具有抗左肺切除复合野百合碱所致大鼠PAH的作用，其机制可能与下调p-Smad2信号通路有关
关键词：肺动脉高压；肺切除术；野百合碱；血管重构；Smad2。
Theeffectsofatorvastatinonpulmonaryarterialhypertensioninduceedbyleftpneumonectomycombinedwithmonocrotalineinratsanditsmechanism
Abstract.
Objective:Toinvestigatetheeffectatorvastatininmonocrotaline(MCT)induceedpulmonaryarteryhypertensionpneumonectomizedrats，andtoexplorethemechanisms．
Methods:Sixty-fourmaleWinsterratsweighting250g-300gwererandomlypidedintothreegroupsofeachthirty-twoanimals：Threegroupswerestudied:1Modelgroup，Onday7afterleftpneumonectomy,pneumonectomizedratswereinjectedsubcutaneouslyinthebackwithmonocrotaline(50mg/kg).2Controlgroupunderwentshamoperation．3treatmentgroupreceivedatorvastatin(20mg/kg)bystomachcatheter.Ratweresacrificed,At7、14、21、28d,meanpulmonaryarterialpressure(mPAP)andrightventriclehypertrophyindex(RVHI)weremeasured.Theexpressionofp-Smad2wasevaluatedbyWesternblot.
Results:Comparedwiththecontrolgroup，themPAPandRVHIweresignificantlyincreasedinmodelgroup(P＜0．05)，thethickeningofpulmonaryarterywasobservedsignificantly,andtheproteinexpressionofthephosphorylationlevelsofSmad2wereup－regulatedobviously(P＜0．05)．Comparedwiththemodelgroup，thepulmonaryarterialpressurewasdecreased(P＜0．05)，theexpressionofp-Smad2washighestinthetreatmentgroup（P<0.05）
Conclusion:AtorvastatinreducedPAPandRVHIintheratPAHmodel,decreasedexpressionofp-Smad2.
Keywords:Pulmonaryarteryhypertension;Monocrotaline;Vasculalremodeling;Atorvastatin.
肺动脉高压(pulmonaryarterialhypertensionPAH)是以肺小动脉血管重构、肺血管阻力升高并进行性加重为主要特征，是众多心肺血管疾病发生发展中重要的病理生理环节，不仅其本身可导致难以控制的右心衰竭，而且可致肺心病、先心病、胶原病等，在病程中、晚期病变进入不可逆阶段，合并PAH而使预后更为恶劣[1]。
目前发病机制尚未完全明确,认为血管重构是PAH发生机制的重要组成部分[2]。肺动脉重构是内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞的增殖与凋亡速率失衡所致，主要表现为肺动脉内皮功能障碍，中膜平滑肌细胞异常增殖、并向内膜迁移，血管外膜胶原沉积，顺应性降低等[3],血管重构的出现,预示着病情进展并直接影响预后。因此对血管重构发生机理的探讨具有重要意义。
有研究表明，在野百合碱（monocrotaline.MCT）诱导的PAH中，阿托伐他汀（atorvastatin.AS）通过改善肺动脉血管重塑以及血管舒张功能而治疗野百合碱诱导的PAH[4]。p-Smad2蛋白表达明显上调，促进了肺动脉重构和肺血管阻力的增加，加速了PAH的发生与发展[5]。
本研究采用左肺切除复合MCT诱导的大鼠肺动脉高压模型，观察AS对其作用，为进一步阐明PAH的机制和治疗提供更多的实验依据。
1材料和方法
1.1模型建立：取健康雄性winster大鼠，体重250～300g；用1%戊巴比妥钠30mg／kg麻醉，给氧，无菌条件下取左前外侧切口，第3～4肋间隙进胸后行左肺切除术，术后恢复1周，后背部一次性注射2%的野百合碱50mg／kg。
1.2动物分组：所有大鼠适应性饲养1周后，查随机数字表，对每一组按随机数字大小进行排序，随机分为：对照组：假手术处理并颈背部一次性皮下注射生理盐水5mL/kg。模型组：左肺切除+野百合碱组（n=32只）。治疗组：左肺切除+野百合碱+AS组（n=32只）,在给予MCT后7、14、21、28天，4个时间点，各分为4个亚组，每组8只。于造模后第1天开始给AS(20mg/kg,ig，qd)，模型组和正常对照组给予等量生理盐水(ig，qd)，
1.3主要实验仪器、设备：病理图像分析仪（MoticimagesAdvanced3.0/OlympusBX41,Japan.）Prucka32导联电生理记录仪（GE，USA）凝胶图像分析系统（ChemiImagerTM40000,lowlightimagingsystem,AlphainnotechCorporation）P23IDStatham压力换能器PV-1型聚乙烯右心导管（中国医学科学院基医学院生理研究所）多导生理记录仪器（华南医电）
1.4主要药品与试剂：野百合碱（美国Sigma公司）阿托伐他汀（美国辉瑞公司）碱性磷酸酶标记二抗（北京中山生物公司）p-smad2多克隆抗体(美国SantaCruz公司)
1.5右心导管法测压：在7、14、21、28天各个时间点测压，用1%戊巴比妥钠30毫克/公斤体重，麻醉后，切开颈部皮肤，分离颈外静脉，用充满0.1%肝素的尖端弯曲的PV-1型聚乙烯管经颈外静脉、右心房、右心室、肺动脉，并通过P23IDStatham压力换能器连接多导生理记录仪器，测定并记录平均肺动脉压。
1.6右心指数测定：测压完毕后，放血处死动物，取出整个心脏称重，仔细分离右室和左室+室间隔，滤纸吸水后，分别称重，计算右室/左室+室间隔的比率，即为右心指数。
1.7取材：取出右肺，预冷PBS冲洗，常规10%甲醛固定，以备光镜检查、免疫组织化学方法检测；其余的右肺组织，置入液氮速冻后，-80℃冻存，以备Westernblot检测。
1.8大鼠肺脏的病理组织学：由哈尔滨医科大学病理教研室协助完成。取10%甲醛固定组织块，4℃保存；标本脱水、透明后，石蜡包埋，切片，常规HE染色，显微镜下拍照。
1.9Westernblot检测：（1）取肺组织1000mg，加裂解液1ml，充分研磨成匀浆（液氮下），离心取上清，分光光度计测OD值，总蛋白质定量。（2）5×SDS加样缓冲液20ul，加80ul样品上清裂解液，混匀后金属浴上100℃煮沸5分钟，离心。（3）15%聚丙烯酰胺凝胶（分离胶）10ml，5%聚丙烯酰胺凝胶（积层胶）4ml。（4）加样：上样量一般为20ul，蛋白含量在80-100ug，marker为5ul。（5）电压设为50V，当染料前进至分离胶电压设置为100V，至2-3小时电泳结束。（6）胶板置于5倍体积考马司亮蓝溶液中染色3h，置于脱色液中，室温，摇床中摇动。观察蛋白质电泳效果。（7）重复上述步骤至电泳结束，取下凝胶、6张3M滤纸、硝酸纤维素滤膜,平放入电泳仪，25V恒压，1.5-2h。（8）将膜用TBS洗3遍，5分钟/次，加一抗(美国SantaCruz公司)1：500，12小时温育后，TBST洗3遍，5分钟/次，加二抗（北京中山公司），1：1000，温育30分钟，用TBST洗3遍，TBS洗2遍。（9）显色：膜在染液中(NBT/BCIP)5-10分钟，条带清晰后弃去染液，去离子水漂洗滤膜。（10）拍照、图像分析：显色的硝酸纤维素膜扫描进计算机后,采用全自动凝胶图像分析系统（ChemiImagerTM40000）进行显色条带的平均吸光度(A)和发光面积(Area)的测定。每一条带蛋白的含量用此条带的累积吸光度(Ac)的数值表示(Ac=A×Area)。
1.10统计学分析：应用SPSS13.0软件分析数据，结果以均数±标准差（±s）表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK检验，P<0.05为有统计学差异；P<0.01为统计学差异明显。
2结果
2.1mRVP、mPAP、RV/（LV+S）的结果，在不同时间点的变化见表1。
2.2HE染色：对照组肺小动脉结构正常（图A*200倍）。模型组中,直径在50～150um的小肺动脉肌组织化明显，内膜的成肌纤维细胞和平滑肌细胞增殖，中层显著增厚，小的弹性纤维混合其中，腺泡内小肺动脉新生内膜形成，使血管管腔明显狭窄、引起管腔闭塞（图B*200倍、C*400倍）。同心性的内膜增殖称为洋葱皮样损害（图D*400倍），在直径小于80µm肌化的小肺动脉观察到存在单层的弹力膜，彻底的将增厚的内膜和中层分隔开来，在对照组的血管中未见到这些表现。中间型的丛状损害由混合着细胞和血管瘤病的区域组成，显示进展中的结构重构。分布在丛状损害周围的淋巴细胞性浸润。
3Westernblot检测：p-Smad2的蛋白表达（1、2、3、4、5条带分别为对照组、7天组、14天组、21天组、28天组，以下相同）。
*P<0.05;#P<0.01，controlgroupVSModelgroup;*#P>0.05,controlgroupof7d、14d、21d、28d。
3讨论
在本研究中，我们采用左肺切除后复合MCT注射的方法建立PAH大鼠模型，当左肺切除后，肺血管床明显减少，导致右肺血流量和血流剪切力的增加，肺动脉压力升高；MCT选择性作用于肺血管床，使肺动脉内皮细胞受损，进而加重肺动脉高压。本研究结果显示，与对照组相比，模型组大鼠肺动脉压升高，小肺动脉新生内膜形成，中膜明显增厚,管腔狭窄,引起管腔闭塞。我们的结果显示不但成模确切，而且便于今后进行重症PAH的研究。
阿托伐他汀作为降脂药而被临床广泛地应用。有研究报道阿托伐他汀可以改善缺氧和野百合碱诱导的PAH。而这一治疗作用有赖于他汀类药物的降脂作用之外的效应，称之“他汀的多效性”[6]，通过减少循环中类异戊二烯中间代谢产物的产生，而阻止信号分子的激活，从而起到抗炎、抗氧化、抗增殖等作用，进而对PAH起到一定的治疗作用[7]。
Smads蛋白是TGF-β超家族细胞内重要的信号转导和调节分子,TGF-β活化的受体可刺激受体调节的Smads蛋白磷酸化,其中TGFβ1可激活P38MAPK，TGF-β1对Smad和MAPK信号的双重作用在TGF-β上皮细胞向间叶细胞的分化中起作用,这种作用部分依赖于p38MAPK途径。因此,Smad和MAPK途径直接激活的平衡是TGF-β的胞内应答正常进行的基础[8]。Smad家族是最早被证实的TGF－β1下游因子，TGF－β1通过Smad蛋白信号转导刺激血管平滑肌细胞的增殖、迁移及纤连蛋白的合成，导致细胞外基质沉积、血管增生，加重肺动脉重构的发生[9]。
我们已发表的研究表明，在左肺切除复合复合野百合碱诱导的PAH中，P38MAPK蛋白的表达明显上调，从而促进了肺动脉重构和肺血管阻力的增加，最终加速PAH的发生与发展[10]。
在本研究中，与正常对照组相比，模型组大鼠肺组织中Smad2的磷酸化水平均明显上调，说明在野百合碱诱导的PAH模型中Smad2信号通路被激活。与模型组相比，阿托伐他汀组大鼠肺组织中Smad2的磷酸化水平均下调，进一步证实,在动物整体水平上，Smad2和p38MAPK细胞信号转导通路与PAH的关系，提示阿托伐他汀可能通过抑制Smad2和p38MAPK信号通路发挥抗肺动脉高压的作用。进而深入探讨了PAH的有关机制。
与模型组相比较，AS组的mRVP、mPAP、RV/LV+S，Smad2的磷酸化水平下调，差异有统计学意义。且具有时间依赖性，提示我们对于肺动脉高压的治疗不应以临床上出现症状或确诊后才给予AS，可以对存在PAH易患因素的病人给以预防性的应用，并且长期应用有累积效应，尤其是合并高脂血症的病人。目前临床对于慢阻肺合并肺动脉高压患者长期联用阿托伐他汀亦能降低肺动脉压[11]。
综上所述，采用左肺切除复合野百合碱注射，可以建立PAH模型。阿托伐他汀通过改善小肺动脉血管重构，治疗左肺切除后复合野百合碱诱导的PAH。本研究的不足之处在于，尚未检测第4周之后的血流动力学变化以及Smad家族相关蛋白的表达而更加全面地探讨PAH的发病机制。
参考文献
1YuanJX，RubinLJ.PathogenesisofPulmonaryArterialHypertension:theneedformultiplehits.Circulation.2005;111（5）：534-8.
2MehranMandegara,Yuan-ChengB.Fungb,WeiHuangb,CarmelleV.Remillarda,LewisJ.Rubina,JasonX.-J.Yuan.Cellularandmolecularmechanismsofpulmonaryvascularremodeling:roleinthedevelopmentofpulmonaryhypertension.MicrovascularResearch，2004；68（2）：75–103.
3BadeschDB，ＲaskobGE，ElliottCG，etal．Pulmonaryarterialhypertension:baselinecharacteristicsfromtheＲEVEALＲegistry［J］．Chest，2010，137(2):376－387
4阿托伐他汀改善野百合碱诱导的慢性肺动脉高压大鼠肺动脉血管重塑与功能
黄邦邦，练桂丽，杜阿胖，中华高血压杂志2017年4月第25卷第4期chinJHypertens,April2017,Vol.25No.4.350-35
5王晓林，王庸晋，荣书玲，等．早期肝细胞生长因子转基因治疗对肺动脉高压大鼠细胞因子表达及肺血管和右心室重塑的影响［J］．中华结核和呼吸杂志，2014，37(6):427－432．
6LiaoJk,LaufsU.Pleiotropiceffectsofstatins[J].PharmacolToxicol,2005,45(45):89-118.
7DinhQN,DrummondGRsobeyCG,etal.Rolesofinflamma-Tion,oxidativestress,andvasculardysfunctioninhypertension[J].BiomedResInt,2014,2014:406960.
8PEYROMAUREM,SCOTTEF,AMSELLEM-OUAZANAD,etal.Trastuzumab(herceptintrademark)inmetastatictransitionalcellcarcinomaoftheurinarytract:reportonsixpatients[J].EurUrol,2005,48(5):771-775.
9LuP，WangSH，CaiWW，etal．ＲoleofTGF－β1/Smad3signalingpathwayinsecretionoftypeIandIIIcollagenbyvascularsmoothmusclecellsofratsundergo-ingballooninjury［J］．JBiomedBiotechnol，2012，doi:1155/2012/965953．
10Theeffectsofatorvastatinonpulmonaryarterialhypertensionandexpressionofp38,p27,andJab1inrats.YUFEI.GAO.etal.2010.INTERNATIONALJOURNALOFMOLECULARMEDICINE.26:541-547.
11何芳刘美成秦勤。长期使用他汀类药物降低COPD患者死亡风险及肺动脉压的Meta分析。药物流行病学杂志2018，27（12）：789-791