禽多杀性巴氏杆菌PlpB基因克隆、表达及表达蛋白生物学特性研究

论文摘要

禽霍乱（Fowl Cholera）是由多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，PM）引起的家禽和野禽的一种急性、接触性、败血性传染病。不同血清型的PM所引起的禽霍乱互相之间无交叉保护作用。研究表明，位于PM菌体表面的PlpB蛋白抗原是一种交叉保护因子（Cross Protective Factors，CPF），对异种血清型菌株的感染能提供一定的保护作用，故该蛋白对开发和研制禽霍乱高效疫苗具有重要意义。本研究针对PMC48-1的PlpB基因的克隆、表达及其表达产物的初步应用开展了以下工作。1．多杀性巴氏杆菌PlpB基因的克隆与高效表达参照GenBank已发表的PM70菌株的PlpB基因序列，设计PMC48-1菌株的PlpB一对寡核苷酸引物。以本实验室保存的C48-1菌株为实验材料，用PCR的方法成功扩增PlpB基因的全序列，该片段共831bp包含一个完整的编码框。将扩增基因插入原核表达载体pGEX-KG，成功构建了重组表达质粒pKG-PlpB，并对pKG-PlpB重组表达质粒进行序列测定，结果表明：扩增序列与GenBank上所报道的PM70株的PlpB基因序列核苷酸同源性在99％以上。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经诱导获得大小约56KDa的表达蛋白（命名为ppB）。Western blot检测表明，该表达蛋白具有良好的反应原性。2．多杀巴氏杆菌PlpB表达蛋白免疫保护作用初步研究以表达蛋白ppB乳化后免疫小鼠，连续免疫3次，第一次间隔14d，第二次间隔7d，并用琼脂双向扩散试验检测血清抗体效价。结果，ppB蛋白的抗血清效价达1/16：采免疫小鼠血清注入非免疫小鼠体内，同时进行主动及被动免疫保护试验，结果表明，所构建的原核表达重组质粒pKG-PlpB在大肠杆菌BL21融合表达的蛋白ppB能诱导小鼠产生免疫反应，可保护小鼠抵抗强毒的攻击，这种免疫保护作用也可通过血清被动传递给非免疫小鼠，使后者获得对强毒的抵抗力。本研究是国内首次构建多杀巴氏杆菌PlpB基因的原核克隆载体和表达载体，并将表达产物进行了初步的动物保护试验，为下一步的交叉保护性试验和禽霍乱亚单位疫苗的研制奠定了基础。

论文目录

• 英文缩写
• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 禽霍乱
• 1.2 禽霍乱的病原学特征
• 1.2.1 病原学分类及亚群分类
• 1.2.2 形态学特征及相关特性
• 1.2.3 多杀性巴氏杆菌的培养特性及理化特性
• 1.3 禽霍乱流行病学及致病机理
• 1.3.1 流行病学
• 1.3.2 临床症状及病理变化
• 1.4 禽霍乱的检测方法
• 1.4.1 细菌学检查
• 1.4.2 凝胶扩撒沉淀试验
• 1.4.3 多杀性巴氏杆菌鉴定的分子生物学方法
• 1.5 禽霍乱的疫苗研究进展
• 1.5.1 弱毒活菌苗
• 1.5.2 禽霍乱灭活菌苗
• 1.5.3 新型疫苗
• 1.6 多杀性巴氏杆菌交叉保护因子的研究进展
• 1.6.1 CFF的发现及其理化特性
• 1.6.2 CPF的提取及其免疫学特性
• 1.6.3 CPF的主要外膜蛋白
• 第2章 禽霍乱PlpB基因克隆、表达及免疫活性分析
• 2.1 研究目的和意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 PlpB基因的扩增
• 2.3.2 重组质粒的提取、PCR扩增及酶切鉴定
• 2.3.3 PlpB基因的序列测定及其比对分析结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 引物的设计、基因组中的模拟PCR错配分析及PlpB基因的克隆
• 2.4.2 PlpB融合蛋白的表达、提取与纯化
• 2.4.3 包涵体的提取及溶解复性
• 2.5 结论
• 第3章 小鼠主动和被动免疫保护性试验
• 3.1 试验目的和意义
• 3.2 试验所用物品及试验动物
• 3.2.1 培养基及制备
• 3.2.2 试验动物
• 3.2.3 试剂
• 3.2.4 方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 血清效价测定结果
• 3.3.2 C48-1细菌生长曲线的绘制
• 3.3.3 动物试验结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 生长曲线的绘制
• 3.4.2 小鼠主动及被动免疫保护试验讨论
• 3.4.3 存在的不足之处
• 3.5 结论
• 参考文献
• 致谢