地涌金莲EST-SSR引物开发与遗传多样性的SSR分析

论文摘要

地涌金莲（Musella lasiocarpa （Franch.） C. Y. Wu ex H. W. Li）属芭蕉科（Musaceae）地涌金莲属（Musella），多年生大型草本植物，主要分布于我国西南地区干热河谷边缘地带，为中国特有的单种属植物。其花型硕大美丽且花期长，具有极高的观赏价值。地涌金莲野生资源数量极少且分布区狭窄，已经处于濒危状态。更好的了解地涌金莲的遗传背景，可以为育种材料的选择、系统演化进一步研究及资源合理利用与保护策略的正确制定提供理论依据。分子标记能直接从DNA水平反映群体及个体之间的遗传差异，是研究植物遗传结构的有力工具。本文从芭蕉属EST数据库中开发出76个地涌金莲SSR标记，其中49对具有多态性。以分布在云南、四川省的9个地涌金莲野生居群为样本，采用22对EST-SSR和8对Genomic-SSR标记从居群遗传学角度探讨地涌金莲的遗传结构。结果如下：1.地涌金莲的EST-SSR标记开发：对芭蕉属EST数据库进行分析，设计并合成了238对引物，有76对引物在所有供试24份地涌金莲材料上均能扩增出清晰的目的条带；49对具有多态性，共检测到147个多态位点，每对引物扩增出等位基因数为2-7个，平均3.0个；各位点的表观杂合度（HO）的变化范围是0.042-0.875，平均0.426；期望杂合度（HE）范围是0.232-0.823，平均0.537。2.野生居群遗传多样性分析：用8对Genomic-SSR和筛选出的22对EST-SSR标记对9个地涌金莲野生居群进行遗传多样性分析，结果显示：Genomic-SSR标记在多态信息含量PIC、检测等位基因数NA和有效等位基因数NE、杂合度和Shannon’s I几个方面都明显高于EST-SSR标记（Genomic-SSR和EST-SSR检测值分别为PIC=0.729/0.527，NA＝11.5/5.5，NE＝5.6/2.7，HE＝0.584/0.743，I＝1.811/1.107）；综合NE、期望杂合度HE、Shannon’s I三类遗传多样性指标对9个野生居群遗传多样性进行评价，得出地涌金莲野生居群总体遗传多样性高，最高的居群为HH（大理鹤庆），其遗传多样性指数为NE＝2.662，HE＝0.554，I＝1.029，最低是居群WY（楚雄武定），其遗传多样性指数为NE＝1.802，HE＝0.372，I＝0.623，由NE、HE和I检测的居群遗传多样性由高至低依次为HH>LJ>WL>YQ>HW>YR>YL>BB>WY；高海拔、高的生境异质性和多种表现型预示着居群遗传多样性较高；居群遗传多样性水平大致沿古红河水系的流向呈下降趋势。3.居群的遗传分化：地涌金莲野生居群固定系数FST介于0.112－0.371，平均为0.244，居群遗传分化程度高，居群间的遗传分化小于居群内个体间的遗传分化，基因流很低，Nm平均为0.793，基因流明显受阻，目前的基因流强度不足以阻止居群间的遗传分化；分子方差分析（AMOVA）表明，有24.13%的变异发生在居群间，75.87%分布在居群内个体间；居群间的遗传距离介于0.157－0.681，根据遗传距离对9个野生居群进行UPGMA聚类，同时结合主座标分析（PCA），在遗传距离为0.33时可分为三个组，沿古雅砻江分布的居群WL、HW和YQ聚为一组，沿古扬子江分布的居群WY与YL聚为一组，沿古金沙江分布的居群LJ、YR、HH和BB共同聚为一组；对居群的遗传距离和地理距离进行Mantel分析，发现二者之间有极显著的正相关关系（R2=0.344, P<0.01）；根据遗传多样性的高低和私有基因数的多少，初步确定居群HH、LJ和WL应优先保护。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 地涌金莲研究进展
• 1.1.3 主要的分子标记方法概述
• 1.1.4 EST-SSR 标记技术及在植物学研究中的应用
• 1.2 研究目标与主要研究内容
• 1.2.1 关键的科学问题与研究目标
• 1.2.2 主要研究内容
• 1.3 研究技术路线
• 1.4 项目来源和经费支持
• 第二章 从芭蕉 EST 数据库中开发地涌金莲的 SSR 标记
• 2.1 实验材料与方法
• 2.1.1 植物材料与 DNA 提取
• 2.1.2 芭蕉属 EST-SSR 序列分析
• 2.1.3 EST-SSR 引物设计
• 2.1.4 PCR 扩增体系及程序优化
• 2.1.5 PCR 产物电泳检测
• 2.1.6 数据分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 DNA 检测
• 2.2.2 芭蕉属 EST-SSR 分布及频率
• 2.2.3 芭蕉属三个种 EST-SSR 的特点
• 2.2.4 地涌金莲 PCR 扩增体系及程序
• 2.2.5 芭蕉属 EST-SSR 引物在地涌金莲中的转移扩增
• 2.2.6 地涌金莲 EST-SSR 引物及 Genomic-SSR 引物的多态性检测
• 2.3 小结与讨论
• 2.3.1 芭蕉属 EST-SSR 分布特点
• 2.3.2 芭蕉属 EST-SSR 引物在地涌金莲中的通用性
• 第三章 基于 SSR 标记的地涌金莲遗传多样性检测
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 EST-SSR 引物与 Genomic-SSR 引物信息
• 3.1.3 多态位点的 PCR 扩增
• 3.1.4 产物电泳及检测
• 3.1.5 数据统计分析方法
• 3.1.6 基于遗传多样性的优先保护居群确定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA
• 3.2.2 EST-SSR 及 Genomic-SSR 检测结果比较
• 3.2.3 地涌金莲野生居群遗传多样性估测
• 3.2.4 地涌金莲野生居群的遗传分化
• 3.2.5 居群间的遗传一致度和遗传距离
• 3.2.6 地理距离和遗传距离的相关性分析（空间遗传结构分析）
• 3.2.7 基于遗传距离的聚类分析
• 3.2.8 地涌金莲优先保护居群的初步确定
• 3.3 小结与讨论
• 3.3.1 EST-SSR 与 Genomic-SSR 标记在多态信息含量水平上的比较
• 3.3.2 地涌金莲野生居群的遗传多样性分析
• 3.3.3 地涌金莲野生居群遗传分化分析
• 3.3.4 空间遗传结构
• 3.3.5 居群遗传组成的独特性
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.2 讨论
• 4.2.1 芭蕉属 EST-SSR 引物在地涌金莲转移扩增
• 4.2.2 古红河水系上游是地涌金莲野生居群的遗传多样性中心
• 4.2.3 生境破碎化是导致地涌金莲野生居群遗传分化的主要原因
• 缩略词表
• 附录
• 参考文献
• 在读期间的学术研究
• 致谢