建立实时荧光定量PCR检测新型隐球菌CAP10基因及临床初步应用

论文摘要

目的建立实时荧光定量PCR（real-time Fluorescent Quantitative PCR,FQ-PCR）系统,定量检测新型隐球菌（Cryptococcus neoformans,CN）荚膜相关蛋白10（Capsule associated protein,CAP10）基因mRNA表达量及其变化,为将其应用于新型隐球菌感染的诊断和疗效判断奠定基础。方法根据新型隐球菌5种血清型（A、B、C、D、AD）中同源序列设计引物和探针, PCR扩增CAP10基因片段,并将其克隆到pGEM-T Easy载体上,构建质粒标准品;建立FQ-PCR体系,优化反应条件,建立标准曲线,进行敏感性、特异性、重复性试验;检测23例新型隐球菌性脑膜炎患者抗真菌药物治疗前后脑脊液（CSF）中隐球菌的CAP10mRNA含量并结合临床和其他实验室资料进行分析。用SPSS10.0统计软件对结果进行统计学分析。结果1. FQ-PCR系统用于检测CAP10基因片段,灵敏度为101拷贝数/μl;批内变异系数（CV）为0.31%,批间CV为2.72%,重复性好;对临床其他常见脑膜炎病原体不出现特异性扩增曲线,特异性好。2.好转组CAP10mRNA拷贝数治疗前、后CAP10 mRNA拷贝数（log10值）分别为1.28、0.75（n=20,P<0.05）,有显著性差异。CAP10 mRNA拷贝数与隐球菌总量呈正相关（r=0.446,P<0.05）,与颅内压呈正相关（r=0.671,P<0.05）,与白细胞计数无关（r=0.173,P>0.05）。两性霉素与5-氟胞嘧啶联用组治疗前、后CAP10 mRNA拷贝数（log10值）分别为3.43、2.35（n=11,P<0.05）,有显著差异;大扶康与5-氟胞嘧啶联用组治疗前、后CAP10 mRNA拷贝数（log10值）分别为2.65、1.84（n=12,P<0.05）,有显著差异;两药物组治疗后CAP10 mRNA拷贝数的下降量分别为1.07、1.06,P>0.05,无显著差异。结论成功建立了新型隐球菌CAP10基因FQ-PCR检测方法,结果稳定、准确,初步提示该系统可用于CN的诊断和疗效判断。

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
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• 前言
• 第一节 建立 FQ-PCR 定量体系检测新型隐球菌 CAP10mRNA
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 FQ-PCR 系统定量检测 CAP10mRNA 及其临床意义
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 综述