论文摘要
背景:小鼠巨噬细胞金属弹力蛋白酶（macrophage metalloelastase,MME）是由活化的巨噬细胞或肿瘤细胞分泌的一种基质金属蛋白酶（MMPs）,与其它MMPs作用不同,MME具有抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长的作用特点。我们先期的研究发现,MME抑制结肠癌生长转移可能与其影响肿瘤血管生成机制有关,需要采用更为可信客观的实验方法和（或）新的研究途径,证实和探讨MME抑制结肠癌生长转移作用及其作用途径。目的:改良以往重组MME质粒的构建、转染和鉴定方法,建立构建携带荧光标记的真核细胞表达载体pEGFP-C1-MME转染小鼠CT-26结肠癌细胞实验方法,论证MME抑制结肠癌生长转移的生物学作用。建立放射性碘标纤溶酶原及其示踪技术,分别在体内和体外实验中,探讨MME降解纤溶酶原生成有生物学功能的血管抑素的途径。同时探讨MME对碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growthfactor,bFGF）等表达的影响,及其对结肠肿瘤生长和微血管密度的抑制作用。方法:将pcDNA3.1-MME和pEGFP-C1分别进行双酶切后,回收、纯化目的基因和表达载体片段,并利用T4 DNA连接酶进行连接,构建成pEGFP-C1-MME重组质粒。pEGFP-C1-MME重组质粒和空质粒（pEGFP-C1）被转染入小鼠CT-26结肠癌细胞中。同时采用RT-PCR、免疫印迹、分解Ⅰ型胶原蛋白实验及明胶酶谱分析方法,鉴定稳定转染细胞中MME的表达情况及重组MME是否具有酶的活性。经皮下注射MME转染的CT-26细胞方法（通过碘化丙叮染色方法来检测细胞活性,只有细胞活性大于90%的单细胞悬液才用于构建动物模型）,建立小鼠皮下种植瘤模型。采用免疫组化和免疫印迹方法检测肿瘤标本中MME的表达;微血管密度计数（MVD）评价肿瘤血管发生情况;免疫荧光染色检测血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）荧光表达强度;应用real-time PCR和免疫印迹检测等检测手段对在结肠肿瘤组织中bFGF mRNA水平和蛋白水平的表达进行检测,并与CT-26细胞转染MME产生血管抑素的实验结果进行比较。制备放射性碘标纤溶酶原,经尾静脉注入小鼠体内,利用放射性示踪技术和针对纤溶酶原（K1-4区域）蛋白的抗体检测纤溶酶原降解片段血管抑素的生成。体外采用改良的Boyden培养小室和MTT实验方法,探讨转染重组MME细胞裂解液（含有血管抑素）对血管内皮细胞迁移和增殖的抑制作用。结果:1.重组MME质粒的构建、转染和鉴定构建的pEGFP-C1-MME经酶切及直接测序鉴定,证明已成功构建带有MMEcDNA片段的绿色荧光表达载体。稳转CT-26细胞并经G418筛选后,在荧光显微镜观察转染细胞GFP（绿色荧光）分布状况时发现,空质粒组GFP分布在整个细胞中,而MME转染组GFP分布于细胞浆中。未转染组及空载体转染组CT-26细胞经Western blot检测,未出现免疫印迹条带,而MME转染组可见一条大小约30kDa的免疫印迹条带,与我们克隆的MME基因所表达的蛋白分子量大小基本一致,即结构域Ⅰ（8kDa）和结构域Ⅱ（22kDa）。体外分解Ⅰ型胶原蛋白实验显示,MME转染组CT-26细胞裂解上清中不溶性的Ⅰ型胶原蛋白已完全被分解为可溶性片段,而未转染组及空载体转染组细胞裂解上清中的Ⅰ型胶原蛋白仍为不溶性。明胶酶谱分析发现,MME转染组有一条明显的明胶被分解后,考马斯亮蓝不能染色的透亮条带,条带的分子量大小约为22kDa,与我们克隆的成熟MME（结构域Ⅱ）的分子量大小基本一致。2.重组MME对结肠肿瘤生长转移及其肿瘤血管生成相关因子的影响构建动物模型成瘤率为94.8%（91/96）,MME转染组小鼠的4周内死亡率（3.3%）明显低于未转染组（26.7%）和空载体转染组（20.0%）,P＜0.05。MME转染组小鼠皮下种植瘤平均体积（816.56±234.02 mm3）小于空质粒组（2071.80.50±608.96 mm3）和未转染组（2231.90±496.91mm3）,P＜0.001。三组中均未发现肝转移。但在空质粒和未转染二个对照组中,胸膜转移率达76.6%（46/60）,而MME转染组中胸膜转移率为36.6%（11/30）,二者比较差异有显著性（P＜0.05）。免疫组化分析中,MME在空质粒组和未转染组肿瘤组织中未见明显表达,而在MME转染组肿瘤组织中明显表达。MME转染组皮下种植结肠癌组织中的MVD平均值（9.35±2.79）明显低于空质粒组（22.85±3.80）和未转染组（23.45±4.49）,P＜0.001。MME转染组VEGF荧光表达强度（20.16±7.32）明显弱于空质粒转染组（60.51±15.19）和未转染组（61.60±17.90）,P＜0.01。Real-time PCR检测表明,MME转染组bFGF mRNA表达水平（0.21±0.042）分别比空质粒组（0.56±0.063）和未转染组（0.53±0.066）低2.7倍和2.5倍,P＜0.01。应用免疫组化和Western blot分析发现,MME转染组bFGF蛋白表达率和表达水平也明显低于空质粒组和未转染组,P＜0.01。3.重组MME产生血管抑素的作用途径研究各组肿瘤标本进行SDS-PAGE电泳,在MME转染组电泳胶中,蛋白分子量为38KD和35KD的区域放射性为6891.88±768.86 cpm,明显高于空质粒转染组（1503.9±304.42 cpm）和未转染组（1376.21±186.36 cpm）该区域放射性,P＜0.01。在Western blot分析中,发现三组均检测出符合血管抑素分子量35KD、38KD片断表达,但通过灰度扫描分析,发现上述二个片断在MME转染组（9.32±1.52 and5.61±2.24）表达强度明显高于空质粒组（2.47±0.23 and 0.67±0.12）和未转染组（1.21±0.69 and 0.86±0.44）,P＜0.01。在血管内皮细胞中同时加入重组纤溶酶原24h后,经Western blot分析,在MME转染组中可以检测到血管抑素（38KD）表达条带,而对照组中未见明显条带出现。采用MTT实验检测方法发现,与对照组比较,MME转染组中血管内皮细胞增殖活性逐渐降低,至72h时,该组血管内皮细胞增殖明显减弱,并出现细胞积聚现象。改良的Boyden培养小室进行体外侵袭实验,发现MME转染组的血管内皮细胞迁移抑制率达25.5%,而对照组分别为4.2%和3.5%。结论:本研究在前期实验研究基础上,成功构建了带有MME cDNA片段的绿色荧光表达载体,并转染入小鼠CT-26结肠癌细胞。在小鼠皮下移植结肠肿瘤模型中进一步证实,MME能够抑制小鼠结肠肿瘤生长、血管生成及其胸膜转移。发现MME具有抑制肿瘤血管生成作用因子bFGF的mRNA及其蛋白表达。同时建立了放射性碘标纤溶酶原及其示踪技术,证实MME具有分解纤溶酶原生成血管抑素的体内作用途径,并能明显抑制内皮细胞的增值和迁移。
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