春石斛（Dendrobium）春化过程中生理生化变化及MADS-box基因的克隆

论文摘要

本文以春石斛（Dedrobium.Pink BEAUTY’Queen’×Dendrobium.Pink GEM’ELEGANCE’）为实验材料，进行春化处理：23±1℃／10±1℃[12h／12h（白天／晚上）]，研究低温对春石斛花芽诱导和分化的效应，在不同时间取样，分析测定了叶片中的碳水化合物，植物各内源激素，EST，POD，SOD同工酶活性及酶谱变化，克隆了与植物开花相关的MADS-box家族的基因，D-MADS，并进行了同源比对及进行叶片、叶芽、不同阶段花芽中的半定量RT-PCR分析。主要实验结果如下：（1）春石斛在40d左右完成春化，芽诱导率达98％，且100％的芽为花芽，2～3朵／节的比例高达80％，每枝有14朵以上的花；未完成春化的植株，芽诱导率低，且大部分发育成叶芽。（2）在低温处理过程中，碳水化合物含量发生变化。在处理的前20d，可溶性糖含量显著增加，随后降低，30d后，糖含量继续增加，40d时达到高峰，179.03mg／g。在处理早期（20d内）淀粉含量逐渐降低，处理20d后又显著上升，40d出现高峰，达到632.96mg／g。处理期间，对照淀粉含量几乎保持不变。淀粉含量与可溶性糖含量变化趋势相反，表明糖含量的增加可能来自淀粉的分解。（3）低温处理过程中，玉米素变化呈双峰曲线。分别在20d和35d达到峰值；IAA含量逐渐增加，20d达到高峰（约为60pmol／gFW），并维持到30d，随后降低；赤霉素呈递增趋势，在35d达到最高水平（约为48pmol／gFW），并保持较高水平到45d，随后含量逐渐降低：ABA含量在处理前期（10d内）显著增加，第10d达到最高水平（约为51pmol／gFW），随后下降，并保持较低水平。IAA／Z在5～35d之间有显著的增加，在35d后又大大降低，几乎与对照保持一致。表明植物内源激素与植物开花有着密切的关联。（4）在处理期间，SOD，POD，EST活性随花芽发育有着明显波动。从EST酶谱上看，春化期间有酶带的消失和重现。春化完成时，出现新的酶带（Rf=0.609）。SOD酶带发生较大的变化，春化完成后，Rf=0.400酶带消失。以上表明同工酶与春化存在一定的关系。（5）根据植物cDNA-3’末端序列的特殊性设计引物（引物2：5’-GACTCGAGTC GATCG ATTTT TTTTT TTTTT TTT-3’）进行cDNA一链的合成，并根据MADS-box基因的保守区域设计上游引物（即引物1：5’-GATCAAG（A／C）G（G／C）ATCGAGAA-3’），克隆得到895 bp的片段，序列分析表明该MADS-box基因的cDNA中包含一个738 bp读码框（ORF），是编码246个氨基酸的MADS-box基因，命名为D-MADS。序列多重比较表明D-MADS与球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum）的DthyrFL1具有97％的相似性，对应的蛋白序列与拟南芥的AP1蛋白具67％的同源性，与球花石斛蛋白DthyrFL1且具有95％的相似性。通过半定量RT-PCR测定D-MADS在春石斛不同组织和花芽发育不同时期的表达情况，结果显示D-MADS在叶和叶芽中均不表达，但随着花的发育，它的表达不断增强。以上结果进一步表明本实验所克隆的D-MADS基因与春石斛花芽发育密切相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写表
• 一、文献综述
• 1 植物春化作用的研究进展
• 1.1 春化作用的概述
• 1.2 植物花芽分化过程中相关生理生化变化
• 1.3 春化分子水平的研究现状
• 2 植物花发育的研究进展
• 2.1 花发育的ABCD模型
• 2.2 MADS-box基因的研究进展
• 3 本研究的目的和意义
• 二、材料与方法
• 1 实验材料
• 2 主要实验仪器
• 3 试剂的配制
• 3.1 培养基的配置
• 3.2 琼脂糖凝胶电泳相关试剂配置
• 3.3 药品和试剂
• 4 实验方法
• 4.1 淀粉含量和可溶性糖含量测定
• 4.2 植物内源激素含量的测定
• 4.3 可溶性蛋白的测定
• 4.4 过氧化物酶（POD）,超氧化物酶（SOD）,酯酶（EST）的提取、活性测定及同工酶电泳分析
• 三、结果与分析
• 1、低温处理对春石斛开花的促进效应
• 2、低温处理过程中淀粉和可溶性糖含量的变化
• 3、低温处理过程中内源激素含量的变化
• 3.1 各激素标样标准曲线及色谱图
• 3.2 低温处理过程中玉米素（Z）含量的变化
• 3.3 低温处理过程中生长素（IAA）含量的变化
• 3）含量的变化'>3.4 低温处理过程中赤霉素（GA₃）含量的变化
• 3.5 低温处理过程中脱落酸（ABA）含量的变化
• 3.6 IAA/Z比值的变化
• 4、低温处理期间SOD,POD,EST活性及同工酶谱的变化
• 4.1 低温处理期间SOD,POD,EST活性的变化
• 4.2 低温处理期间SOD,EST同工酶谱的变化
• 5、MADS-box基因克隆与表达分析
• 5.1 春石斛花芽RNA的提取
• 5.2 春石斛花芽MADS-box基因的PCR扩增
• 5.3 春石斛MADS-box基因cDNA的核苷酸序列及其氧基酸序列分析
• 5.4 D-MADS保守区分析
• 5.5 D-MADS在春石斛不同组织中表达
• 四、讨论
• 1、春化过程中碳水化合物的变化
• 2、春化过程中植物内源激的素变化
• 3、春化过程中同工酶的变化
• 4、春石斛MADS-box基因与开花之间的关系
• 五、结论与展望
• 六、参考文献
• 七、附录
• 八、致谢