论文摘要
捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）属毛圆科（Trichostrongylidae）血矛属（Haemonchus）线虫，分布较广，寄生于反刍动物第四胃和小肠，因吸血可导致贫血和衰弱，引起幼龄动物，尤其是羔羊死亡，对畜牧业造成极大经济损失。凝集素是自然界广泛存在的一大类非免疫来源的、无酶活性的糖类结合蛋白，能促使细胞发生凝集。其生物学作用涉及到许多重要的生理和病理活动，如受精、发育、细胞增殖、分化，内环境稳定、免疫应答、感染、炎症、癌细胞转移及与血栓形成有关的心脑血管疾病等等。半乳糖结合凝集素是其中的一类，也具有广泛的功能，参与细胞粘附、凋亡及免疫反应等多种生物学过程。凝集素在植物中的研究已有一百多年的历史，但在线虫中的研究相对较晚，尤其是捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素（galectin）的研究只有十几年的时间。1994年，Smith从捻转血矛线虫肠道粘膜分离到一种糖蛋白复合物——H-gal-GP，用其免疫羔羊然后攻虫，发现虫卵排出减少＞90％，成虫减少＞70％，是一种很好的疫苗候选抗原。此后，捻转血矛线虫的galectin基因不断被克隆和鉴定，作为疫苗的候选抗原也逐渐受到关注。此前，我们实验室分别从雌性、雄性捻转血矛线虫体内克隆到了Hco-gal-f（Acc.no.AY253331）和Hco-gal-m（Acc.no.AY253330）两个完整的galectins编码序列，并分别表达了它们。在此研究基础上，我们进行了以下工作：1．捻转血矛线虫重组galectins对山羊外周血淋巴细胞细胞因子mRNA转录的抑制作用以体外试验观察雌、雄性捻转血矛线虫重组半乳糖结合凝集素（rHco-gal-m／f）蛋白对山羊外周血淋巴细胞多种细胞因子mRNA转录水平的影响及其量效关系。选用2岁健康山羊5只，分别从颈静脉无菌采血，分离外周血淋巴细胞，以ConA或LPS刺激细胞的同时分别加入Oμg／ml、10μg／ml、20μg／ml和40μg／ml的rHco-gal-m／f进行体外培养。用RT-PCR方法，以β-actin作内标，定量分析淋巴细胞中白介素-1β（IL-1β）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、白介素-6（IL-6）、干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA丰度。结果显示，雄性捻转血矛线虫重组半乳糖结合凝集素（rHco-gal-m）可以抑制上述细胞因子mRNA的转录，并呈现出明显的剂量依赖性；雌性捻转血矛线虫重组半乳糖结合凝集素（rHco-gal-f）可抑制IL-1β、IL-4、IFN-γand TNF-αmRNA的转录，也呈现出明显的剂量依赖性。结果表明重组的捻转血矛线虫galectins能降低多种细胞因子在体外的转录。2．捻转血矛线虫重组galectins诱导山羊淋巴细胞凋亡的作用为了探讨雌、雄性捻转血矛线虫重组半乳糖结合凝集素（rHco-gal-m／f）诱导天然宿主山羊外周血淋巴细胞凋亡的作用，采用电镜观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术等方法，检测了对淋巴细胞凋亡的影响。结果显示，电镜下可见大量的细胞核固缩、碎裂，染色体被染成深蓝色或蓝黑色，染色质边集，出现典型凋亡小体的凋亡细胞；DNA凝胶电泳可见典型的梯形条带；流式细胞术定量分析发现rHco-gal-m／f诱导山羊外周血淋巴细胞凋亡，并呈现明显的时间和剂量效应关系。3．捻转血矛线虫重组galectins抗凝血作用为了研究捻转血矛线虫重组galectins蛋白的抗凝血作用，应用试管法观察了该重组galectin蛋白对8只山羊凝血时间的影响。结果显示，雄、雌性捻转血矛线虫重组galectin蛋白均有相似的抗凝血活性，能显著延长山羊血液的凝血时间（P＜0.01，P＜0.01）；随着蛋白浓度的增加，抗凝血作用也逐渐增强。说明捻转血矛线虫重组galectin蛋白具有一定的抗凝血作用，其机制有待于进一步研究。4．捻转血矛线虫重组galectins的免疫保护性试验使用雌、雄性捻转血矛线虫重组galectin蛋白，对9-10月龄山羊做了免疫保护性试验。健康山羊16只，随机分成4组，每组4只。第一组每次免疫10mgrHco-gal-m／f（5mg rHco-gal-m和5mg rHco-gal-f），第二组每次免疫5mgrHco-gal-m／f（2.5mg rHco-gal-m和2.5mg rHco-gal-f），同时设立不攻虫对照组和攻虫对照组。第一次免疫使用弗氏完全佐剂和重组抗原混合乳化，第二次免疫使用弗氏不完全佐剂和重组抗原混合乳化，在试验山羊的背部皮下多点注射免疫，两个对照组用1ml PBS代替重组抗原，共免疫两次，间隔2周。10mg免疫组，5mg免疫组和攻虫对照组山羊于第二次免疫14天后口腔接种5000条捻转血矛线虫第三期感染性幼虫。从攻虫后第22至34天，每隔一天采集粪便，虫卵计数。攻虫后35天，屠宰山羊，剖解皱胃，分离雌雄虫体，分别计数。结果显示，在试验结束时，10mg免疫组与攻虫对照组相比，山羊虫卵排出减少37.25％（P＜0.05），荷虫数减少41.1％（P＜0.05）；5mg免疫组，山羊虫卵排出减少48.03％（P＜0.01），荷虫数减少46.19％（P＜0.01）。说明重组galectin蛋白对山羊捻转血矛线虫的感染有部分的免疫保护效果。5．捻转血矛线虫重组galectins诱导的血清与局部抗体反应使用雌、雄性捻转血矛线虫重组galectin蛋白，对9-10月龄山羊做免疫保护性试验的同时，使用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，测定了所有试验山羊血清特异性免疫球蛋白IgG滴度、血清IgA浓度以及胃粘膜表面和胃粘膜组织匀浆中IgA浓度。结果显示，攻虫前，10mg和5mg免疫组山羊血清特异性rHco-gal-m／f抗体IgG滴度均极显著地高于不攻虫对照组（P＜0.01）和攻虫对照组（P＜0.01）；两个免疫组的血清IgA水平有所升高。攻虫后，10mg和5mg免疫组血清特异性rHco-gal-m／f抗体IgG滴度极显著地高于不攻虫对照组（P＜0.01）和攻虫对照组（P＜0.01）；10mg、5mg免疫组和攻虫对照组的血清IgA水平明显高于不攻虫对照组（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05）。两个免疫组和攻虫对照组山羊的胃粘膜表面IgA浓度明显高于不攻虫对照组（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）。10mg和5mg免疫组山羊的胃粘膜组织匀浆IgA浓度显著高于攻虫对照组（P＜0.05，P＜0.05）。此外，10mg和5mg免疫组之间的血清特异性免疫球蛋白IgG滴度、血清IgA浓度以及胃粘膜表面和胃粘膜组织匀浆中IgA浓度差异均不显著。特异性rHco-gal-m／f抗体IgG水平与山羊捻转血矛线虫荷虫数之间呈显著的负相关性关系（r=-0.657，P＜0.05）；胃粘膜组织匀浆IgA浓度与山羊荷虫数之间呈显著的负相关性关系（r=-0.692；P＜0.05）。说明特异性rHco-gal-m／f抗体IgG水平和胃粘膜组织匀浆中的IgA水平在抵抗捻转血矛线虫感染的过程中可能起到重要的作用。6．捻转血矛线虫重组galectins诱导山羊的CD4+、CD8+T和B淋巴细胞免疫应答为了探索山羊获得性免疫保护机理，使用雌、雄性捻转血矛线虫重组galectin蛋白免疫山羊后，利用流式细胞术，检测了所有试验山羊外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞和B淋巴细胞所占比例。结果显示，攻虫前，10mg免疫组CD4+T淋巴细胞水平显著高于不攻虫对照组（P＜0.01）；10mg免疫组CD8+T淋巴细胞水平显著高于不攻虫对照组（P＜0.01）；5mg和10mg免疫组的B淋巴细胞水平显著高于不攻虫对照组（P＜0.05，P＜0.05）。攻虫后，10mg、5mg免疫组和攻虫对照组CD4+T淋巴细胞水平显著高于不攻虫对照组（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05）；攻虫对照组的CD8+T淋巴细胞水平明显高于10mg免疫组（P＜0.01）；攻虫对照组的B淋巴细胞显著高于5mg和10mg免疫组（P＜0.01，P＜0.01）。此外，10mg和5mg免疫组之间的CD4+、CD8+T和B淋巴细胞水平差异均不显著。山羊的B淋巴细胞水平与山羊捻转血矛线虫荷虫数之间呈显著的正相关关系（r=0.587，P＜0.05）。7．捻转血矛线虫重组galectins诱导山羊的外周血粒细胞和单核细胞免疫应答雌、雄性捻转血矛线虫重组galectin蛋白免疫山羊后，对所有试验山羊的外周血中嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和血红蛋白进行了检测。结果显示，攻虫前，10mg和5mg免疫组山羊的嗜酸性粒细胞浓度显著高于不攻虫对照组（P＜0.01，P＜0.01）；10mg免疫组山羊的嗜中性粒细胞浓度显著高于不攻虫对照组（P＜0.01）；10mg和5mg免疫组山羊的单核细胞水平逐渐上升；各组山羊的血红蛋白浓度没有明显差异。攻虫后，10mg、5mg免疫组和攻虫对照组山羊嗜酸性粒细胞浓度显著高于不攻虫对照组（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）；10mg免疫组的嗜中性粒细胞浓度明显高于攻虫对照组（P＜0.05）；5mg免疫组和攻虫对照组山羊的单核细胞浓度明显高于不攻虫对照组（P＜0.05，P＜0.01）；两个免疫组和不攻虫对照组的血红蛋白水平显著高于攻虫对照组（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）。此外，10mg和5mg免疫组之间的粒细胞、单核细胞和血红蛋白水平差异均不显著。山羊的嗜酸性粒细胞浓度与累积EPG之间存在正相关关系（r=0.537）；单核细胞浓度与山羊荷虫数之间存在明显的正相关关系（r=0.636，P＜0.05）；血红蛋白浓度与山羊荷虫数之间存在显著的负相关关系（r=-0.744，P＜0.05）。
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