论文摘要
随着工业生产的迅速发展和人民生活水平的不断提高,大量含持久性生物累积性有毒污染物（Persisitent Bioaccumulative Toxic Pollutants, PBT）的污水直接或间接进入水体,使水环境受到了日益严重的污染。由于PBT污染物具有“环境持久性”,在环境中可以长期积累,所以环境系统中积累几种PBT污染物也随之日益普遍。因此,多种PBT污染物在环境系统中的联合毒理效应及其机理的研究,受到了人们越来越多的重视。虽然有人研究了PBT污染物对细胞的毒性及其诱导细胞凋亡的机制,但PBT污染物联合作用对细胞的毒性效应鲜见报道,且其诱导细胞凋亡的具体作用机制尚不清楚,因此本文采用胰蛋白酶分离法成功的分离鲫鱼肝细胞,并以原代培养鲫鱼肝细胞为研究对象,研究了不同浓度镉（Cadmium, Cd）（0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L）和五氯酚（Pentachlorophenol, PCP）（0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L）及其联合作用（0.1、1、10μmol/L）对原代培养鲫鱼肝细胞的毒性效应及其诱导细胞凋亡的机理。主要研究内容和结果如下：（1）探讨了原代培养鲫鱼肝细胞的分离、培养、鉴定,研究了Cd和PCP单独及联合作用对原代培养鲫鱼肝细胞活力的影响,同时测定Cd和PCP单独及联合作用下鲫鱼肝细胞形态学的变化。结果表明,0.25%胰蛋白酶消化法可以分离出鲫鱼肝实质细胞,但含有大量的肝非实质细胞和细胞碎片,用差速离心法提纯3次,可使肝细胞纯度达到92%以上。肝细胞活力随着Cd或PCP浓度的增大,细胞活力逐渐降低,并呈现剂量-效应关系。与对照相比,低浓度Cd或PCP处理差异不大,高浓度处理组差异达到显著性水平。联合染毒组表现出交互作用,析因分析结果表明交互作用为协同效应。利用透射电子显微镜检测到原代培养鲫鱼肝细胞的凋亡特征,如观察到明显的胞浆浓缩,核染色质凝聚,核膜消失,线粒体肿胀和空泡化,线粒体嵴断裂或消失,凋亡小体的出现等。（2）利用微量热法研究了Cd和PCP单独及联合作用对原代培养鲫鱼肝细胞的毒性作用。结果发现,不同浓度Cd和PCP作用下,鲫鱼肝脏细胞代谢均出现停滞期、活性恢复期、稳定期和活性衰减期四个时期；鲫鱼肝细胞代谢活性恢复期速率常数k,最大放热功率pmax,总产热量（Q）,传代时间（tG）,均受到Cd和PCP的影响。随着Cd和PCP浓度的升高,速率常数k值逐渐减小,总产热量（Q）下降,而代谢抑制率和传代时间逐渐增加。这说明鲫鱼肝细胞在代谢过程中受到Cd和PCP的抑制作用,并且Cd对鲫鱼肝细胞的毒性作用高于PCP,二者的交互作用表现为协同作用。（3）研究了Cd和PCP单独及其联合作用对原代培养鲫鱼肝细胞CAT、POD、SOD及GSH代谢相关酶的活性,同时测定了MDA、GSH、GSSG的含量。CAT、POD活性均表现出相同的趋势,即在低浓度Cd和PCP作用下CAT、POD活性被激活,随着浓度的增高CAT、POD活性逐渐减弱直至受到抑制。SOD和GST活性随着Cd和PCP浓度的增大呈下降趋势。低浓度的Cd对GSH-Px活性有诱导作用,当浓度大于1μmol/L, GSH-Px活性被显著抑制,差异达极显著水平：而在PCP单独作用下,浓度小于10μmol/L时,差异变化不大,高浓度时GSH-Px活性被显著抑制。GR活性随着Cd浓度的增大逐渐降低：PCP浓度较低时,GR活性有被激活的趋势,当浓度大于1μmol/L时GR活性显著降低。在Cd和PCP单独作用下,GST活性表现出相同的趋势,即随着污染物浓度的增加活性逐渐降低。MDA含量随着Cd和PCP浓度的升高逐渐增加。GSH含量随着浓度的升高逐渐降低,呈现良好的剂量-效应关系。在Cd单独作用下,GSSG含量先增大后降低,当Cd浓度为100μmol/L时,差异达显著性水平（P<0.05）；在PCP单独作用下,GSSG含量逐渐增大,呈现良好的剂量-效应关系。析因分析表明Cd和PCP联合作用时表现出交互作用。（4）研究了Cd和PCP单独及联合作用对原代培养鲫鱼肝细胞Na+,K+-ATPase、 Ca2+,Mg2+-ATPase活性和[Ca2+]i含量的影响。研究发现在Cd单独作用时,Na+,k+-ATPase活性逐渐减弱；PCP作用时,Na+,k+-ATPase活性先增强后减弱。Cd和PCP对Ca2+,Mg2+-ATPase活性表现出相同的变化趋势,即Ca2+,Mg2+-ATPase在低浓度Cd和PCP时,酶活性有所增强,高浓度时酶活性显著降低。[Ca2+]i的含量在低浓度Cd或PCP下变化不大,高浓度时[Ca2+]i含量显著增大。Cd和PCP联合作用下鲫鱼肝细胞Na+,K+-ATPase、Ca2+,Mg2+-ATPase活性都低于对照组,析因分析表明,Cd和PCP之间存在着交互作用,表现为协同效应。Cd和PCP联合作用组[Ca2+]i含量要高于对照组,析因分析表明,Cd和PCP联合作用对[Ca2+]i含量的影响同对ATPase活性的影响一样,也存在着协同作用。（5）研究了Cd和PCP单独及联合作用对原代培养鲫鱼肝细胞SOD、ΔΨm、DNA Ladder和凋亡率的变化,探讨Cd和PCP诱导原代培养鲫鱼肝细胞凋亡的分子机制。原代培养鲫鱼肝细胞△Ψm随着Cd和PCP浓度的增高逐渐降低,差异达极显著水平。凋亡率在Cd和PCP较低浓度下不明显,当Cd和PCP浓度达到10时,凋亡明显增加,在100μmol/LCd或PCP作用下,凋亡比率显著升高,差异达到极限制水平。DNA Ladder显示在高浓度Cd和PCP时呈现典型的“梯状”条带,结果同凋亡率相一致。在Cd和PCP联合作用下,△Ψm降低,析因分析表明,在Cd和PCP浓度低时,交互作用不明显,当浓度为10μmol/L时交互作用明显,表现出协同作用。联合作用组凋亡率增大,析因分析表明,在Cd和PCP浓度低时,交互作用不明显,当浓度为10μmol/L时交互作用明显,表现出协同作用。