皱纹盘鲍表达谱基因芯片研制及不同表型家系差异表达基因的初步研究

论文摘要

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)自然分布于我国黄渤海区,是我国北方海区的重要养殖贝类。但至今有关皱纹盘鲍的功能基因研究尚处于起步阶段,在核酸数据库中,注册的皱纹盘鲍核酸序列仅 92 条,其中含功能基因序列 23 条,在这23 条功能基因中,涵盖的基因种类数为 8 种。同时,目前在整个鲍科物种中 EST研究都非常缺乏,鲍的注册 EST 数仅有 26 条,其中来源于耳鲍(Haliotis asinina)的 14 条、九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)的 12 条。 EST 大规模测序技术和基因表达谱芯片技术,具有高通量快速性的特点,可以同时处理分析大量实验样本,在生物功能基因组研究中发挥了巨大的作用,它们已被广泛应用于新基因的克隆、组织特异性基因表达谱分析以及基因组序列的功能注释等许多研究领域。EST 测序分析成为大规模获取功能基因一种最为快捷和有效的研究手段(Delseny et al., 1997; Ablett et al., 2000)。因此,借鉴其它生物成功的经验,通过建立皱纹盘鲍表达基因文库,进行 EST 序列分析,可能在较短时间内获得较多的皱纹盘鲍功能基因表达信息;而表达谱基因芯片可以帮助我们获得与表型相关的差异表达基因。 本文通过文库构建、序列分析、生物信息学分析、表达谱基因芯片的研制和应用等途径,获得如下结果: 1. 选取壳色表型为橘红色的突变品系 RwRh 家系的个体构建了 cDNA 文库。 2. 对 cDNA 文库进行 EST 测序,获得了 4494 个长度大于 150bp、精度大于 90%的 EST 序列。通过 DNAtools 软件对上述 4494 条 EST 进行同一性分析之后,得到了 3205 条无冗余的独立 EST。再用 3205 条无冗余的独立 EST 与核酸数据库和蛋白质数据库分别进行了 BlastN 和 BlastX 序列同源性比对。 在 BlastN 比对结果中,178 条 EST 与已知功能基因的序列有较高同源性;9条 EST 与具假定功能的序列有较高同源性;3 条 EST 与功能尚不明确的基因有较高同源性;还有 10 条 EST 与非功能序列有较高同源性。与已知功能的基因具较高同源性的 178 条 EST 序列可按功能分为 7 类:能量代谢(34 条),细胞结构

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 鲍的生物学特征以及养殖现状
• 1.2 皱纹盘鲍的遗传学研究现状
• 1.3 皱纹盘鲍功能基因的研究现状
• 1.4 EST 的技术原理和应用
• 1.4.1 EST 的定义和技术原理
• 1.4.2 EST 技术的应用
• 1.4.3 生物信息学在EST 中的应用
• 1.5 应用基因芯片技术寻找表达差异基因
• 1.6 其它差异表达基因研究方法
• 1.6.1 差异显示和随机引物聚合酶链反应技术
• 1.6.2 cDNA 消减杂交技术
• 1.6.3 SAGE 技术
• 1.6.4 SDGE-microarray
• 第二章 皱纹盘鲍cDNA 文库的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 第三章 皱纹盘鲍EST生物信息学分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 cDNA 与载体连接
• 3.1.2.2 cDNA 序列测定
• 3.1.2.3 序列编辑
• 3.1.2.4 序列同一性分析
• 3.1.2.5 功能基因注释
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 EST 测序结果
• 3.2.1.1 测序概况
• 3.2.1.2 EST 序列长度分布统计
• 3.2.1.3 EST 序列的同一性分析
• 3.2.1.4 EST 序列末端信息
• 3.2.2 与核酸蛋白数据库 Blast 比对结果
• 3.2.2.1 与核酸数据库 Blast 比对结果
• 3.2.2.2 与蛋白数据库比对结果
• 3.3 讨论
• 3.3.1 EST 的核酸比对结果讨论
• 3.3.2 EST 的蛋白比对结果讨论
• 3.3.3 主要功能基因分类
• 第四章 皱纹盘鲍表达谱芯片的制备
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 基因芯片靶基因EST 序列的扩增
• 4.1.2 EST 序列扩增产物的电泳检测
• 4.1.3 EST 序列扩增产物的浓度检测
• 4.1.4 EST序列扩增产物电泳检测结果统计
• 4.1.5 EST 序列扩增产物的沉淀纯化
• 4.1.6 纯化产物的溶解以及定量
• 4.1.7 纯化产物的转板
• 4.1.8 384 孔板中纯化产物的冷冻抽干
• 4.1.9 384 孔板中纯化产物的溶解
• 4.1.10 阴阳性对照的制备
• 4.1.11 皱纹盘鲍表达谱芯片的点制
• 4.1.12 芯片点样后处理
• 4.1.13 芯片质量检测
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 靶基因EST 序列扩增产物浓度
• 4.2.2 靶基因EST 序列扩增产物电泳检测结果
• 4.2.3 EST 序列扩增产物沉淀纯化结果
• 4.2.4 芯片质量检测结果
• 第五章 皱纹盘鲍表达谱芯片杂交结果的初步分析
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 皱纹盘鲍样本的选择
• 5.1.2 总RNA的准备
• 5.1.2.1 总RNA 的提取
• 5.1.2.2 总 RNA 质量检测
• 5.1.2.3 总RNA样品的纯化
• 5.1.2.4 总RNA样品纯化产物质量检测
• 5.1.3 荧光探针的制备
• 5.1.4 荧光探针的纯化
• 5.1.5 荧光探针的定量
• 5.1.6 芯片杂交
• 5.1.7 芯片洗涤
• 5.1.8 芯片扫描及数据读取
• 5.2 结果
• 5.2.1 总RNA 质量检测结果
• 5.2.2 荧光探针质量检测结果
• 5.2.3 芯片杂交结果
• 5.2.3.1 芯片杂交扫描结果
• 5.2.3.2 杂交结果中表达差异基因
• 5.3 讨论
• 5.3.1 总RNA 质量电泳检测
• 5.3.2 芯片杂交结果讨论
• 5.3.2.1 两组杂交实验结果的比较
• 5.3.2.2 实验结果重复性的讨论
• 5.3.2.3 其它检验芯片质量的方法
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢