论文题目: 简单节杆菌生物转化17α-甲基睾丸素C1，2-脱氢制备美雄酮
论文类型: 硕士论文
论文专业: 微生物与生化药学
作者: 别松涛
导师: 杜连祥
关键词: 甲基睾丸素,美雄酮,简单节杆菌,生物转化
文献来源: 天津科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 甾体激素药物的母核在其C1,2位引入双键后,能成倍地提高其药理活性。与化学方法相比,采用微生物法脱氢,具有反应条件温和、专一性强以及转化率高等优点,已成为甾体激素药物生产中的重要反应之一。去氢17α-甲基睾丸素（Dehydro-17α-methyltestosterone）,商品名美雄酮（Methandienone）是一种蛋白质同化激素,与17α-甲基睾丸素相比较,具有同化作用强,但雄性激素样作用弱的优点。论文就17α-甲基睾丸素生物脱氢的菌种选育、生物转化工艺技术以及产物美雄酮的分离纯化等方面进行了深入的研究。 选育了适用于17α-甲基睾丸素生物转化脱氢的微生物菌种。从实验室收集、保藏的3株简单节杆菌中,通过摇瓶转化试验,进行菌种的初筛,并经过菌种的分离、纯化,得到转化率较高的DK31-2-50菌株。 对DK31-2-50菌株转化17α-甲基睾丸素的工艺条件进行研究。通过单因素实验和正交试验优化,确定的较佳培养基组成为（g/L）:葡萄糖10,玉米浆12,酵母膏5,KH2PO42.5。生物催化17α-甲基睾丸素C1,2位脱氢的最适条件为:接种量5%,培养基初始pH 6.4,摇床转速在培养期采用160r/min、转化期采用220r/min,采用底物粉末直接投入法,并加入4%的DMSO分散转化结束后,发酵液中出现较大的产物结晶,最终转化率达70%以上。 在摇瓶试验的基础上进行7L发酵罐放大试验,确定了相关操作参数,为工业化生产提供有价值的方案。
论文目录:
1 前言
1.1 甾体化合物概述
1.1.1 甾体化合物的结构
1.1.2 甾体化合物的分类
1.1.3 甾体化合物的临床应用
1.2 甾体化合物的微生物转化
1.2.1 甾体化合物的微生物转化
1.2.2 甾体化合物微生物转化反应的特点
1.2.3 甾体化合物微生物转化反应的共性难题
1.2.3.1 甾体底物的溶解性
1.2.3.2 甾体底物与转化酶的有效接触
1.3 甾体化合物C_(1，2)-位微生物脱氢的研究进展
1.3.1 用于甾体化合物C_(1，2)位脱氢的微生物
1.3.2 甾体化合物C_(1，2)位脱氢的机理
1.3.3 甾体化合物C_(1，2)位脱氢的酶学性质
1.4 本论文研究的对象和主要内容
1.4.1 美雄酮的用途
1.4.2 微生物法制备美雄酮的开发前景
1.4.3 本论文的研究内容
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 试剂
2.1.2 实验仪器
2.1.3 实验菌种
2.1.4 培养基
2.1.4.1 斜面培养基
2.1.4.2 种子培养基
2.1.4.3 发酵培养基
2.1.5 发酵条件及转化条件
2.1.5.1 斜面培养
2.1.5.2 种子培养
2.1.5.3 发酵培养
2.1.5.4 转化条件
2.2 实验方法
2.2.1 菌种生长曲线的确定
2.2.2 底物17α-甲基睾丸素投料方法
2.2.2.1 干粉投料
2.2.2.2 溶解投料
2.2.3 提取、分离方法
2.2.4 生物量的测定
2.2.4.1 比浊法
2.2.4.2 细胞干重的测定
2.2.4.3 发酵液浊度与细胞干重的关系
2.2.5 C_(1，2)-位脱氢酶活力的测定
2.2.5.1 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)显色法
2.2.6 17α-甲基睾丸素转化率的测定
2.2.6.1 薄层层析法(TLC)
2.2.6.2 高效液相色谱法(HPLC)
2.2.7 催化细胞的制备
2.2.8 底物的溶解度试验
3 结果与讨论
3.1 优良菌株的选育
3.1.1 保藏菌株的17α-甲基睾丸素脱氢性能研究
3.1.2 菌株的分离与纯化
3.1.3 菌株31—2—50的形态特征
3.2 摇瓶发酵条件的优化
3.2.1 摇瓶发酵条件的优化
3.2.1.1 适宜斜面培养时间的确定
3.2.1.2 斜面冻藏时间对转化率的影响
3.2.1.3 接种量对转化的影响
3.2.1.4 pH值对转化的影响
3.2.1.5 摇瓶发酵培养基组成及配比的单因素试验
3.2.1.6 最佳培养基组成和配比的确定
3.2.1.7 最佳培养基的验证实验
3.2.2 摇瓶转化条件的研究
3.2.2.1 摇床转速对去氢甲基睾丸素转化的影响
3.2.2.2 投料方法与去氢甲基睾丸素转化率的关系
3.2.2.3 底物投料浓度对转化的影响
3.2.3 回收底物再转化实验
3.2.3.1 回收底物再转化
3.2.3.2 产物浓度对转化的影响
3.3 7L发酵罐放大实验
3.3.1 正批底物7L发酵罐发酵过程
3.3.2 回收底物7L发酵罐放大发酵过程
3.4 发酵液后处理工序的研究
3.4.1 去氢甲基睾丸素的提取、分离方法
3.4.2 去氢甲基睾丸素生产工艺流程
3.4.3 产物去氢甲基睾丸素结构与质量测定
3.5 两相系统中生物催化17α-甲基睾丸素Δ~(1，2)-脱氢的初步研究
3.5.1 有机溶剂及催化细胞的选择
3.5.2 表面活性剂浓度的影响
3.5.3 甲萘醌浓度的影响
3.5.4 细胞浓度的影响
3.5.5 两相系统中动力学的初步探索
4 结论
5 展望
参考文献
致谢
论文发表情况
附录Ⅰ 美雄酮的核磁共振谱图(氢谱)
附录Ⅱ 美雄酮的核磁共振谱图(碳谱)
发布时间: 2007-01-10
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