干旱胁迫下黄檗消减文库的构建及Ⅱ型MT基因的克隆

论文摘要

黄檗是古热带区孑遗植物，经历了从第三纪炎热到寒冷等一系列的气候变迁，对自然界的非生物胁迫（如高温、干旱、寒冷）有很强的适应力，为国家二级保护植物。为研究干旱胁迫下黄檗的基因表达情况，本论文以干旱胁迫下的黄檗幼苗cDNA为tester，正常生长的黄檗幼苗组织cDNA为driver，利用抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization，SSH）构建了干旱胁迫下黄檗幼苗的消减文库。从消减文库中随机挑取20个阳性克隆，提取质粒进行酶切和PCR鉴定，显示文库克隆的重组率大于95％，插入片段大部分集中在300～800bp之间。随机挑取816个克隆进行测序，得到265个基因。将其进行同源性分析，将其划分为16类，获得了如热激蛋白70、脱水响应蛋白（RD22）、通用胁迫蛋白、金属硫蛋白（MT2），晚期胚胎丰富蛋白（LEA14）等44种与干旱胁迫相关的基因，它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。所得160个EST序列已被GenBank和EST数据库收录。从文库中选取金属硫蛋白基因（MT2）进一步研究，根据测序得到的序列设计MT2特异性引物，通过5’cDNA末端快速扩增（RLM-RACE）技术克隆了其5’端序列。将5’RACE产物克隆入pGEM-T载体后，转化测序，并根据测序结果重新设计引物，克隆了MT2编码区序列，从而得到了MT2的全长序列。黄檗MT2基因mRNA全长852bp，ORF分析表明，其在112bp处具有起始密码子ATG，315bp处有终止密码子TGA，具有240bp的完整的开放读码框，预测编码79个氨基酸。经过Blast分析，发现它在核酸序列上与柑橘、柳树类MT序列有80％的序列同源性，且同源区域覆盖cDNA100％；其假定氨基酸序列与柳树类MT2A蛋白在55个氨基酸序列中有70％的同源性，说明黄檗金属硫蛋白与已知MT有明显的同源性，可以预测其具有与已知MT类似的功能。综上所述，利用SSH技术构建了黄檗幼苗在干旱胁迫下差异表达基因文库，通过生物信息学分析研究了干旱胁迫过程中相关基因的表达情况，克隆了金属硫蛋白基因的全长序列，为进行黄檗分子生物学的研究奠定了基础，同时为植物基因工程提供了丰富的抗逆基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 绪论
• 1.1 黄檗的研究现状
• 1.2 植物抗旱基因工程研究进展
• 1.2.1 植物应对干旱的生物学反应
• 1.2.2 干旱胁迫下植物的代谢调节网络
• 1.3 抑制性消减杂交技术（SSH）简介
• 1.3.1 抑制性消减杂交的原理与实验过程
• 1.3.2 SSH技术的优点和主要缺陷
• 1.4 cDNA末端快速扩增技术简介（RACE）
• 1.4.1 RLM-RACE的基本原理
• 1.4.2 RACE技术的优点和缺点
• 1.4.3 PCR扩增过程的优化
• 1.5 论文主要内容和研究意义
• 1.5.1 主要研究内容
• 1.5.2 研究意义
• 2 黄檗cDNA消减文库的构建
• 2.1 实验材料和试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要引物序列
• 2.2 实验过程
• 2.2.1 水势的测定
• 2.2.2 黄檗总RNA的提取
• 2.2.3 黄檗mRNA的分离
• 2.2.4 抑制性消减文库的构建
• 2.2.5 文库的转化和阳性克隆鉴定
• 2.2.6 文库的测序和EST生物信息学分析
• 2.2.7 EST序列提交Genbank
• 2.3 实验结果与分析
• 2.3.1 叶片水势的测定结果
• 2.3.2 黄檗总RNA和mRNA的提取
• 2.3.3 双链cDNA的合成与Rsa I酶切效率分析
• 2.3.4 消减杂交后两轮PCR扩增产物结果分析
• 2.3.5 文库的质量分析
• 2.3.6 EST序列的同源性分析
• 2.3.7 序列提交Genbank
• 2.4 本章小结
• 3 RACE技术克隆金属硫蛋白基因全长序列
• 3.1 实验材料与试剂
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 引物序列
• 3.2 实验过程
• 3.2.1 MT基因特异性引物设计
• 3.2.2 黄檗总RNA提取及mRNA纯化
• 3.2.3 mRNA脱磷酸化
• 3.2.4 mRNA帽子结构的去除
• 3.2.5 mRNA与RNA Oligo的连接
• 3.2.6 mRNA的反转录
• 3.2.7 MT 5’末端PCR扩增
• 3.2.8 5’ RACE产物的克隆、筛选和测序
• 3.2.9 MT cDNA序列克隆
• 3.2.10 MT序列的生物信息学分析
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 MT基因特异性引物设计
• 3.3.2 总RNA提取和mRNA纯化
• 3.3.3 5’RACE的扩增
• 3.3.4 5’RACE产物的克隆、筛选
• 3.3.5 cDNA序列的克隆
• 3.3.6 全长序列的拼接、ORF分析
• 3.3.7 BLAST分析
• 3.3.8 氨基酸序列同源性比对分析
• 3.3.9 进化树分析
• 3.4 本章小结
• 结论
• 结论
• 讨论与展望
• 下一步研究方向
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢