论文摘要
背景与目的：当今，随着辐射源和核能的广泛和平利用，在给人类带来莫大利益的同时，也使人类接触各种射线的机会明显增加。其中包括从事某种职业过程中受到的职业性照射，因接受医学诊断和治疗而受到的医学照射，一般居民从所有其它辐射源受到的公众照射，以及核辐射事故照射和可能发生的核战争引起的照射等。因此，对人类接受辐射照射后出现的生物效应与健康危害进行定量评价是放射医学与辐射防护科学研究中的重点，它涉及能源、环境和战争，具有重要的社会与政治经济意义。辐射危害评价是以辐射剂量为基础，对照射后出现的不同种类的生物效应进行定量分析。受照剂量通常采用物理剂量估算和生物剂量估算，而对于照射条件明确的大剂量急性照射，用物理剂量估算方法能较为准确的估算受照剂量，对于照射条件复杂或不明原因的急性事故照射（如河南新乡“4．26”辐射事故和山西忻州事故）、核战争引起的照射、职业性照射、核医学诊治和放射治疗全身等效剂量当量的估算，物理剂量学方法存在很大的不确定性，不能准确估算受照剂量。而利用一些生物学观察指标（如染色体畸变、微核、基因突变等）与受照剂量呈正相关关系建立的生物剂量计，可以在任何照射条件下对受照剂量做出较为准确的估算。目前国内外利用最普遍，公认最实用准确的生物剂量计估算剂量方法当属染色体畸变。但是染色体畸变作为生物剂量计估算剂量方法也有其明显的缺点，如需要进行细胞培养，受照后3天才能给出准确的结果，以及需要有丰富经验的细胞遗传学技术人员等。因此利用现代分子生物学技术，建立能快速准确和高通量的估算生物剂量的分子水平的辐射生物剂量计已成当今研究的重点。线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）由于缺少组蛋白和非组蛋白的保护、缺乏有效的基因修复系统以及线粒体自身的特点使之极易受到外界因子的损伤而发生突变。常见的突变类型有点突变、缺失和插入突变等，其中以mtDNA 4977 bp缺失最为常见。有研究表明，辐射可特异性诱导此缺失的产生。目前，国内外有关辐射致mtDNA 4977 bp缺失的研究刚刚起步，相关文献报道较少。本研究通过对电离辐射诱发的人外周血mtDNA4977bp缺失片段的克隆和序列分析，建立了应用实时定量PCR对该缺失片段进行定量分析的方法，为建立分子水平的辐射生物剂量计奠定基础。同时对健康人外周血样品进行检测和定量，以探索健康人外周血mtDNA 4977 bp的缺失情况。材料与方法：选取年龄在25岁的健康男、女性各1例，近期无X射线照射史，采集静脉血30ml，EDTA钠盐抗凝，平均分成6份，用于60Coγ射线离体照射，照射剂量分别为0、1、2、3、4和5 Gy。照射后的血样在37℃水浴中放置2 h后进行白细胞线粒体DNA的萃取，通过限制PCR的反应条件进行mtDNA 4977 bp缺失片段的PCR扩增。通过PCR产物的胶回收纯化及与克隆载体的连接，进行质粒的转化和蓝白斑筛选试验，通过挑取阳性克隆、提取质粒和酶切鉴定，进行测序和序列分析。对测序正确的质粒通过A260测量其浓度，倍比稀释后建立标准曲线；依据标准曲线建立电离辐射诱发人外周血mtDNA4977bp缺失的定量PCR分析方法。同时选取年龄在17～44岁的健康人共27例，收集其外周血各5ml，提取mtDNA，用实时定量PCR方法对每个样品同时检测mtDNA 4977 bp缺失的量和无4977 bp缺失的量，进行定量分析。结果：（1）电离辐射诱发mtDNA 4977 bp缺失片段的PCR扩增产物的大小与理论预期值大小（129bp）基本一致；PCR产物经酶切鉴定显示与插入PCR产物的大小相一致；序列分析结果表明本文测定的序列就是跨mtDNA 4977 bp缺失片段的序列；定量PCR分析的初步结果表明，在0-4Gy范围内，随着剂量的增加mtDNA 4977bp缺失量有增加的趋势。（2）在27例健康人外周血样品中，mtDNA 4977 bp缺失的阳性率为70.37％（19／27）；不同年龄组间mtDNA 4977 bp缺失量无统计学差异，不同年龄组间无mtDNA 4977 bp缺失量也无统计学差异。结论：（1）通过在mtDNA 4977 bp缺失片段两侧设计引物，PCR方法克隆得到了电离辐射诱发的跨4977bp缺失的129bp的DNA片段；建立了mtDNA 4977 bp缺失片段定量PCR的分析方法，初步结果表明mtDNA 4977bp缺失可能在0—4Gy照射剂量范围内对生物剂量估算有重要意义。（2）大约70％的健康人外周血中有mtDNA4977 bp的缺失；在有该缺失的健康人样品中大约每106～107拷贝的mtDNA中携带有一个4977 bp缺失；随年龄的增长健康人外周血中mtDNA 4977 bp的缺失未显示出累积现象。