论文摘要
红系分化相关基因（Erythroid differentiation-associated gene, EDAG）特异表达于造血组织和细胞,参与造血细胞增殖、分化、及凋亡的调控,但目前对其作用机制了解甚少。本论文以EDAG的相互作用蛋白质为切入点,探讨了EDAG可能的作用机制,着重研究了EDAG与HSP70的相互作用及生物学意义,并提出EDAG/HSP70/GATA-1的调控模式。论文采用免疫共沉淀联合质谱分析技术,从HEK293及K562细胞中分离鉴定了EDAG的相互作用蛋白质,通过对所获得的候选蛋白质进行细胞定位、生物学功能、疾病相关性、基因敲除表型等分析,共获得高可信度相互作用蛋白质20种,并选出NPM1、HSPA1A、FBL、TRA2A、COPS4及RNF113A等6种蛋白质采用Co-IP实验方法进行验证,其中5个为阳性,表明所获数据具有较高的可靠性,数据的系统分析为揭示EDAG的生物学功能及作用机制提供了有价值的线索。在此基础上选出可调控造血相关转录因子GATA-1的热休克蛋白-70（HSP70）进行了深入研究。共定位、Co-IP等实验表明EDAG与HSP70存在生理性相互作用,并确定EDAG与HSP70的相互作用是通过HSP70的ATPase结构域介导的;研究发现HSP70表达可增强EDAG的转录激活活性,并具有剂量-效应关系,而EDAG可增加HSP70蛋白质的入核,并增加转录因子GATA-1蛋白质的稳定性。研究还发现EDAG可增加转录因子GATA-1的转录活性,下调EDAG可抑制GATA-1下游靶基因的表达;ChIP实验也表明EDAG可在体内结合到多种GATA-1靶基因的启动子序列。这些结果提示EDAG可能通过调控GATA-1发挥调控造血的功能。进一步利用免疫共沉淀实验证明EDAG/HSP70/GATA-1在体内可形成复合体,提示三者可能相互影响从而共同调控造血发育。综合以上结果,我们认为:EDAG可通过与多种蛋白质结合从多个角度发挥其功能,其中EDAG与HSP70的相互作用及对GATA-1的影响可能是其调控造血的重要方式。我们提出的基本模式是:EDAG/HSP70/GATA-1在体内形成复合体,EDAG可增加HSP70在细胞核中的分布,一方面HSP70可能增加该复合体的稳定性,特别是GATA-1蛋白质的稳定性,另一方面HSP70可能协助EDAG募集转录辅助因子而增加EDAG的转录激活活性,并进而影响GATA-1的转录活性。EDAG/HSP70/GATA-1三者共同作用,从多个角度调控基因特别是GATA-1下游靶基因的表达,从而参与造血调控。
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