论文摘要
第一部分EB病毒感染与胃癌发生关系的研究目的明确胃癌组织中EB病毒（Epstein-Barr Virus,EBV）潜伏期和裂解期基因的表达情况,在分子水平探讨EBV及其编码基因在胃癌发生发展中的作用。方法应用PCR-Southern杂交检测185例胃癌组织和相应癌旁组织中特异性EBV DNA,进一步用原位杂交技术检测PCR阳性标本石蜡切片组织中EBV小RNA（EBER1）的表达,以确证EBV相关胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）。应用RT-PCR和Southern杂交检测EBVaGCs组织中EBV启动子（Qp、Wp和Cp）、潜伏期基因（核抗原EBNA1和EBNA2,潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A和LMP2B）和裂解期基因（即刻早期基因BZLF1和BRLF1,早期基因BARF1和BHRF1,晚期基因BcLF1和BLLF1）的表达。结果①185例胃癌组织中有13例为EBVaGCs（7.03%）,相应癌旁组织均为阴性,二者之间EBV检出率的差别有显著性（χ2=11.0769,P=0.0009）。统计学分析表明EBVaGCs和EBV阴性胃癌（EBV-negative gastric carcinoma,EBVnGC）在年龄、病理类型、临床分期、淋巴结转移和发病部位的差异均无显著性,P值分别为0.669,0.141,0.259,0.818,0.064,但性别之间的差异有显著性,男性EBV阳性率高于女性（χ2=3.9404,P=0.0471）。②13例EBVaGCs组织中EBV启动子Qp表达阳性而Wp和Cp均为阴性。③潜伏期基因EBNA1表达均为阳性,有5例LMP2A表达阳性,而EBNA2、LMP1和LMP2B mRNA均为阴性。④裂解期基因中即刻早期基因BZLF1有6例表达阳性,而BRLF1 mRNA均为阴性;早期基因中有6例BARF1表达阳性,2例BHRF1表达阳性;晚期基因BcLF1有7例表达阳性,而BLLF1 mRNA均为阴性。结论①EBV感染与胃癌的发生发展有一定相关性,EBVaGC好发于男性,但EBV感染与胃癌病人年龄、病理类型、临床分期、淋巴结转移和发病部位无明显相关性。②EBVaGC组织中病毒潜伏状态为Ⅰ型潜伏或介于Ⅰ和Ⅱ型潜伏之间的独特类型。③部分EBVaGC组织中可检测到EBV裂解期基因的表达,早期基因BARF1和BHRF1在胃癌发生和发展过程中可能发挥重要作用,但EBV部分裂解期基因发生的机制以及在胃癌发生发展过程中的作用有待进一步研究。第二部分EB病毒对人胃癌细胞系HSC-39感染的研究目的探讨EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）对人胃癌细胞系的感染作用和感染机制。方法采用Akata和P3HR-1 EBV毒株分别感染人胃印戒细胞癌细胞系HSC-39,有限稀释法对感染细胞进行克隆。对感染的亲代细胞及细胞克隆进行下述检测:免疫荧光检测EBV核抗原（EBNA）、原位杂交检测EBV小RNA1（EBER1）以及PCR-Southern检测EBV基因组以确证EBV感染。镜下观察细胞形态学变化,MTT法和细胞软琼脂试验检测细胞增生能力。Western印迹检测EBV核抗原（EBNA）1、EBNA2、潜伏膜蛋白（LMP）1、ZEBRA和早期抗原D（EA-D）的表达;RT-PCR和Southern杂交检测EBNA2、LMP1、LMP2A和EBNA启动子Qp、Wp、Cp的表达。流式细胞技术（FACS）和RT-PCR检测CD21分子的表达。结果①HSC-39细胞对两种EBV毒株均易感,感染的亲代细胞及细胞克隆均可检测到EBV EBNA及EBER1的表达,所有EBNA阳性克隆及部分阴性克隆中均检测到EBV DNA。②两种EBV毒株感染的细胞克隆表现出不同的形态学特征及生长方式。③EBV感染的亲代细胞及大部分细胞克隆表达EBNA1,但不表达EBNA2、LMP1和LMP2A;EBNA启动子Qp表达阳性,而启动子Cp、Wp未见表达。亲代细胞及所有细胞克隆未观察到裂解感染。④未感染的HSC-39细胞及P3HR-1感染的细胞克隆CD21表达阴性,而Akata EBV感染的部分细胞克隆CD21 mRNA呈低水平表达。结论①HSC-39细胞对两种EBV毒株均易感,EBV感染可改变HSC-39的细胞表型,且不同EBV毒株对其影响不同,提示印戒细胞癌细胞系可用作EBV感染的靶细胞。②EBV可通过CD21受体非依赖途径感染HSC-39细胞。第三部分LMP1沉默对AP-1信号转导通路的影响目的探讨LMP1沉默对AP-1信号转导通路及其下游与细胞转化,增殖,分化和凋亡相关因子的影响。方法应用50nM靶向LMP1功能区编码序列的siRNA649转染EBV阳性的胃癌上皮细胞GT38,采用Hoechst 33258和透射电镜技术检测GT38细胞凋亡情况;RT-PCR方法检测LMP1沉默对c-Jun,survivin,CDK4和MMP9的mRNA转录表达的影响;免疫组化方法检测survivin蛋白表达的改变;Western Blotting检测对c-Jun,JunB和CDK4蛋白表达的影响。结果①Western blotting结果显示,与细胞对照比较,转染siRNA649后48h未检测到LMP1的表达,转染后72和96h时LMP1的表达减弱。②Hochest 33258染色可见siRNA649作用后的GT38细胞发生凋亡,透射电镜观察到GT38细胞线粒体空泡化,染色质固缩;而转染非特异性对照siRNA的GT38细胞未观察到上述改变。③RT-PCR、Western Blotting以及免疫组化检测结果显示:与GT38细胞对照比较,LMP1特异性沉默后,c-Jun,survivin,JunB和MMP9表达水平降低,CDK4表达上调。结论靶向LMP1功能区编码序列的siRNA6可有效干扰LMP1的表达,LMP1特异性沉默可影响AP-1及其下游相关因子的表达,进而抑制细胞增殖,促进细胞调亡。
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