中药抑制剂血清药理学研究及对相关基因影响

论文摘要

本文以耐药机制清楚的金黄色葡萄球菌为试验菌,探讨复方黄连注射剂的体外耐药抑制作用和含药血清的药理作用与抑菌能力,同时探讨复方黄连注射剂对诱导耐药金葡菌的DNA旋转酶亚单位A基因（gyrA基因）序列的影响,初步从分子水平探讨复方黄连注射剂的耐药抑制分子机理,为复方黄连注射剂及中药耐药抑制剂的开发应用提供一定的研究基础。本研究的第一部分是确定6株乳源性耐药金葡菌的耐药谱和耐药性,建立耐药菌株库,探讨复方黄连注射剂的体外耐药抑制作用。同时通过质粒消除试验,初步了解复方黄连注射剂的耐药分子基础,为后续试验奠定基础。试验结果表明,6株乳源性耐药金葡菌对氧氟沙星、诺氟沙星、阿莫西林、头孢噻吩、环丙沙星等抗菌药均具有抗药性,为多重耐药株。通过采用不同浓度梯度的诺氟沙星、环丙沙星、阿莫西林、头孢噻吩逐级诱导建立了耐各种水平药物的耐药菌株库。挖孔法、药敏纸片法试验结果表明：复方黄连注射剂可显著提高耐药金葡菌对氟喹诺酮类药物的敏感性,具有耐药抑制作用。质粒消除试验表明,耐药金葡菌的耐药性与质粒无关。本研究的第二部分是通过对流动相的组成、柱温、保留时间、紫外检测波长等多因素考核和筛选,建立反相高效液相色谱法测定复方黄连注射剂和含药血清中盐酸小檗碱浓度的方法,并通过血药浓度的测定,进行血清药理学研究,初步了解复方黄连注射剂的体内药效作用。复方黄连注射剂含药血清药理学研究结果表明：复方黄连注射剂含药血清对耐药性金葡菌具有明显的耐药抑制作用,对S1～S5的MIC为0.125μg/ml,对Sa6为0.25μg/ml.抑菌圈直径在14-17mm之间,说明盐酸小檗碱是复方黄连注射剂中起抗菌作用的主要成分。本研究的第三部分是探讨金葡菌对氟喹诺酮类耐药与gyrA基因序列突变的关系及复方黄连注射剂对诱导耐药金葡菌gyrA基因序列的影响。gyrA基因序列突变和氨基酸序列突变分析表明：细菌的耐药性程度越高,碱基突变和氨基酸突变率增加。本试验结果表明：gyrA基因32、43和125等碱基多位点突变,可导致金葡菌对诺氟沙星产生耐药；251和295位碱基突变,则会导致其高水平耐药。经复方黄连注射剂处理的耐药金葡菌gyrA基因序列发生了251位碱基C→T和295位碱基A→G的回复突变作用；氨基酸序列发生了84位缬氨酸→丝氨酸、99位氨基酸谷氨酸→赖氨酸的回复突变作用,因此耐药金葡菌对诺氟沙星敏感性大大提高,产生耐药抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1 国内外研究现状
• 1.1 细菌耐药性机制研究
• 1.2 耐药抑制剂研究进展
• 1.3 中药耐药抑制剂研究
• 1.4 中药血清药理学研究
• 1.5 金黄色葡萄球菌gyrA基因突变与耐药性的关系
• 2 研究目的和意义
• 第二章 中药耐药抑制剂的体外耐药抑制作用研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 药敏试验结果
• 2.2 金黄色葡萄球菌诱导性耐药株的建立
• 2.3 复方黄连注射剂的体外抑菌试验
• 2.4 复方黄连注射剂的体外耐药抑制试验
• 2.5 耐药性金黄色葡萄球菌质粒消除试验结果
• 3 讨论
• 3.1 耐药性检测
• 3.2 影响药敏试验的因素
• 3.3 耐药株的诱导
• 3.4 复方黄连注射剂的耐药抑制剂作用
• 3.5 质粒的消除
• 4 结论
• 第三章 中药耐药抑制剂血清药理学研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 试验结果
• 2.1 标准曲线的建立
• 2.2 复方黄连注射剂高效液相色谱测定结果
• 2.3 复方黄连注射剂含药血清高效液相色谱测定结果
• 2.4 复方黄连注射剂含药血清MIC测定结果
• 2.5 复方黄连注射剂含药血清抑菌圈直径测定结果
• 3 讨论
• 3.1 高效液相色谱条件的优化与建立
• 3.2 血清药理学研究
• 3.3 含药血清的处理
• 3.4 复方黄连注射剂含药血清的抑菌作用
• 4 结论
• 第四章 gyrA基因突变与细菌耐药的关系及中药耐药抑制剂的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 试验结果
• 2.1 耐药菌的诱导结果
• 2.2 PCR引物设计
• 2.3 PCR条件的筛选与建立
• 2.4 复方黄连注射剂处理后PCR电泳结果
• 2.5 标准株、诱导耐药株和复方黄连注射剂处理的耐药株gyrA基因序列测定结果
• 2.6 标准株、诱导耐药株和复方黄连注射剂处理耐药株gyrA基因氨基酸序列及突变分析结果
• 3 讨论
• 3.1 引物对PCR的影响
• 3.2 模板对PCR的影响
• 3.3 gyrA基因序列突变与细菌耐药性的关系
• 3.4 gyrA基因氨基酸突变与DNA旋转酶活性的关系
• 3.5 gyrA基因氨基酸突变与细菌耐药性的关系
• 3.6 复方黄连注射剂对gyrA基因碱基突变与氨基酸突变的影响
• 4 结论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介