论文摘要
本文对毛白杨种质资源库进行长期观测,系统调查了毛白杨花器官的表型性状,收集覆盖其发育全部过程的9个时间点的花芽用于后续实验。对杨树花发育过程响应温度胁迫的生理生化指标进行了测定。选取特定时期的雌雄花芽进行温度胁迫实验,验证雌雄花器官响应温度胁迫的差异性。同时,由种质资源库中发现了3株雄全同株个体。利用雄全同株个体为实验材料,通过Affymetrix杨树全基因组基因表达芯片对其两性花的雌雄花器官之间差异表达基因进行了筛选与功能注释,通过Cytoscape软件从分子功能,生物途径与细胞组件等3个水平进行基因富集分析。依据富集分析结果挑选候选基因,利用荧光定量PCR对重要候选基因在花发育过程中的表达模式进行了分析。同时利用高通量测序技术对两性花的雌雄花器官之间差异表达的microRNA进行了筛选,并对其靶基因进行了预测与验证。通过荧光定量PCR技术分析显示microRNA及其靶基因间具有负调控关系。差异表达基因和microRNA分析暗示了DNA甲基化修饰在花发育过程中具有重要意义。因此,通过MSAP的方法对两性花的雌雄花器官之间差异的DNA甲基化修饰位点进行了筛选。通过片段回收,克隆得到了一系列与开花发育相关的候选基因。通过荧光定量PCR验证DNA甲基化修饰与基因表达的关系。从差异表达基因中筛选得到SUPERMAN基因在花序形态发育过程具有重要作用。对该基因在杨树中的单核甘酸多态性以及基因表达模式进行了检测。得到如下主要结果：1、毛白杨3个花器官表型性状、雄株9个物候性状及雌株6个物候性状在群体间与群体内无性系个体之间都存在极显著差异。雄性花器官表型变异系数平均值为11.62%,变异系数最大的是物候性状中的开花始期（19.25%）,花序凋落末期为最小（5.86%）。雌性花器官表型变异系数平均值为13.3%,最大值是授粉始期（37.24%）,最小值是花序开放末期（5.21%）。毛白杨雄性花器官3个表型性状分化系数变化幅度为8.36%-20.07%,雌性花器官分化系数变化幅度为2.52%-26.43%。2、基因表达谱芯片结果显示共有10,096探针在雌雄花器官中差异表达,5760个基因在雄花中上调表达,4336个基因在雌花中上调表达。基因功能富集分析显示两条涉及转录因子活性的通路上的GO注释都被显著富集,证明了杨树雌雄花器官发育过程中存在显著差异的转录调控机制。其中光周期途径中的PIL、GIGANTEA （GI）以及CONSTA-LIKE（COL）在雄花中显著上调。而花发育的负调节基因TERMINAL FLOWER1（TFL1）则在雄花中显著下调,证明雌花发育过程中的光周期途径相对雄花受到了抑制作用。在赤霉素途径中,共检测到16个与赤霉素生物合成相关的基因,其中7个基因在雌雄花器官中呈现特异的表达模式。检测到92个生长素相关基因,其中29个基因具有雌雄花器官特异的表达模式,此外,还检测到4个细胞分裂素相关基因以及3个DNA甲基化相关基因在雌雄花器官之间差异表达,表明激素代谢与DNA甲基化调控也参与了雌雄花器官特异的发育过程。差异表达基因在基因组中的物理位置分析显示在杨树性别决定区段内存在一个差异表达富集区,其中包括两个重要的DNA甲基化转移酶基因MET1和DDM1。利用Realtime-PCR检测了重要候选基因在杨树花发育过程中的表达模式。3、利用高通量测序技术检测了雄全同株花器官之间差异表达的microRNA,结果共检测到134个保守microRNA,其中microRNA397和microRNA6462在雄花中特异表达,而microRNA6459在雌花中特异表达,其余131个在花器官之间差异表达显著。在检测到的78个新microRNA,有11个在雄花中特异表达,61个在雌花中特异表达,6个microRNA在雌雄花器官之间差异表达.新的nicroRNA的靶基因预测结果显示平均每个microRNA作用于1-15个靶基因位点。靶基因Gene ontology分析显示在分子功能水平上响应激素刺激,负调节基因表达,调节花发育以及器官形成等注释被显著富集。差异表达microRNA及其靶基因在基因组物理位置分析,发现有一新的microRNAPto-F70与其他新microRNA的4个靶基因位于杨树性别决定区段内。利用Realtime PCR验证了microRNA与靶基因的负调控关系,构建了microRNA与靶基因相互作用网络,证明microRNA在杨树花器官发育过程中具有广泛的调节作用。4、利用110对MSAP引物组合对雄全同株两性花器官的DNA甲基化差异位点进行了分析。共检测到212个DNA甲基化差异位点,其中有53个为性别特异的谱带。在检测到的19个雄花特异的DNA甲基化位点中,有14个半甲基化位点与5个全甲基化位点。在检测到的33个雌花特异的DNA甲基化修饰位点中,包括24个半甲基化修饰与9个全甲基化修饰。而仅有一个位点在雌花中属于全甲基化修饰,而在雄花中是半甲基化修饰。对其中的35个差异条带进行了切胶回收与测序,最终得到27条序列。其中MF26,MF29,以及MF35分别与PtGT2,PtPAL3,以及PtCER4基因同源。利用qPCR检测了三个候选基因时空特异的表达模式。同时,通过MS-PCR检测候选基因DNA甲基化模式。整合两部分结果显示,基因转录区上的DNA甲基化修饰对候选基因具有上调表达调控。5、对毛白杨在自然环境下花器官发育过程中以及温度胁迫处理下的生理生化指标进行了测定。分析显示,雌雄花器官在温度胁迫下抗氧化酶活性增加。但在发育过程中,雌花中抗氧化酶活性高于雄花。与抗氧化酶系统密切相关的基因PtoSOD2、 PtoPOD21以及PtoCAT1在雌花中的表达量显著高于雄花。这一结果显示在温度胁迫处理下,雌花相对雄花不仅具有更高的抗氧化系统活性,同时也具有更多的抗氧化酶蛋白。雌花还具有相对较高的钙离子浓度以及钙离子运输相关基因的表达丰度。而在雄花中MDA含量高于雌花表明雄花膜系统经历了相对多的过氧化反应,暗示了雌花器官的膜系统具有较强的抗逆境胁迫能力。6、PtoSUP基因家族成员在除未成熟木质部外的其他组织中都能检测到表达。其中,在幼叶中,PtoSUP1与PtoSUP2均为中等丰度表达。而在雌花中PtoSUP1基因表达量是PtoSUP2的6.54倍。相反,在雄花中PtoSUP2基因表达量相对PtoSUP1高7.01倍。外源激素处理实验表明PtoSUP基因家族成员表达受赤霉素信号诱导。PtoSUP1在雌全同株花器官中等丰度的表达可能导致了其两性花器官的产生。PtoSUP1基因的核苷酸多样性系数为πT=0.00248,显示出较低的多态性。在PtoSUP1基因的编码区域,非同义突变明显低于同义突变,非同义突变与同义突变之比小于1,结果建议,PtoSUP1在毛白杨进化过程中受到了纯化选择作用。PtoSUP1基因在不同群体间的GST以及FST指数变化范围为-0.00129至0.06836,表明PtoSUP1核苷酸序列在毛白杨不同群体间的遗传分化不显著。本文对毛白杨雄全同株个体产生的两性花器官之间的差异表达基因、miRNA、DNA甲基化修饰位点进行了系统的分析,初步阐明了杨树雌雄花器官发育遗传调控的分子机制,为毛白杨花器官发育研究提供了大量的候选基因,且为研究杨树性别决定机制奠定了理论基础。