淫羊藿素减轻急性肝损伤及其分子机制研究

论文摘要

[研究背景与目的]淫羊藿素是近年来倍受关注的具有抗氧化、防治骨质疏松、心血管疾病、保护神经变性损伤、防治乳腺癌的单体药物。用于分离淫羊藿素的箭叶淫羊藿,自古以来是一种重要的传统中草药。淫叶藿经多重步骤的萃取与硅胶层析、洗脱后,可制得淫羊藿素。淫羊藿素与其前体物质淫羊藿苷具有极其相似的分子结构。其不同之处在于A环7位的糖苷链被羟基所代替（见图1）。从药物构效关系的角度推测其抗氧化功能将进一步增强。目前有关淫羊藿素的研究证实:1、通过降低前列腺癌细胞线粒体的跨膜电势,减少pRb、Cyclin D1及CDK4蛋白的磷酸化使前列腺癌细胞阻制于G1期从而产生抑制癌细胞增殖的作用;2、原代培养神经细胞的药理研究发现,淫羊藿素可通过拟雌激素样作用引起细胞增殖,减轻β样淀粉酶对神经细胞的损伤;3、诱导胚胎干细胞分化;4、可通过抑制酪氨酸蛋白激酶的表达、减轻细胞缝隙间连接蛋白的损伤减轻血管内皮细胞的缺氧损伤;5、通过其抗氧化作用可促进成骨细胞的增殖,抑制破骨细胞,从而防治骨质疏松症。各种原因导致的肝损伤是临床工作中经常遇到的问题,肝脏保护一直是研究的热点问题。有关肝损伤保护药物的研究、基因治疗、外科干预措施等一直是较为活跃的领域之一,但仍缺乏高效的多靶点的保肝药物。肝损伤的病理过程中,活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）对细胞脂质、蛋白质、核酸的氧化作用是主要的损伤途径。结合淫羊藿素已有的研究背景,我实验室前期研究已经证实淫羊藿素可以减轻脂肪肝小鼠的缺血再灌注损伤。我们推测其可能存在减轻急性化学性肝损伤的药理作用,有望成为治疗肝损伤的治疗药物。本研究着重进行淫羊藿素瘁灭活性氧簇、拟雌激素样作用调节肝细胞细胞内氧化还原状态的体内外实验研究,初步评价淫羊藿素治疗急性肝损伤的作用,探讨其可能的分子机制。[研究方法]1淫羊藿素减轻CCL4诱导大鼠肝细胞损伤的体外实验:建立大鼠肝细胞CCL4损伤模型,以淫羊藿苷为阳性对照药物,在不同剂量淫羊藿素作用下,应用MTT法测定药物作用前后细胞存活率的变化、自动生化分析仪测定培养上清ALT、AST的含量、分光光度法测定细胞培养上清MDA、细胞内SOD的变化,荧光显微镜观察肝细胞ROS荧光强弱的变化,并对实验数据进行统计学处理。2淫羊藿素减轻CCL4诱导大鼠肝细胞凋亡的体外实验:建立大鼠肝细胞CCL4凋亡模型,以ICI182,780作为雌激素受体阻断药物,应用Western blot方法检测不同浓度淫羊藿、不同作用时间后肝细胞PPARα和L-FABP蛋白以及BCL-2/BAX凋亡相关蛋白表达的变化、细胞免疫化学染色检测肝细胞L-FABP的表达水平、流式细胞仪及TUNNEL法检测肝细胞的凋亡比率及形态学变化,并对实验数据进行统计学处理。3淫羊藿素减轻CCL4诱导小鼠急性肝损伤的体内实验:利用去势C57BL/6雌性小鼠建立CCL4急性肝损伤动物模型。以雌激素为阳性对照药物、ICI182,780作为雌激素受体阻断药物,利用分光光度计测定血清ALT、AST的含量及肝组织MDA、SOD的变化、Realtime-PCR方法检测肝组织内PPARα和L-FABP转录水平的变化、HE组织切片染色评估肝组织损伤的差异、组织免疫化学染色测定肝组织L-FABP蛋白的表达水平、TUNNEL法检测肝细胞的凋亡比例及形态学变化,并对实验数据进行统计学处理。[实验结果]体外实验1淫羊藿素对CCL4损伤大鼠肝细胞存活率的影响:随着淫羊藿素浓度的升高,CCL4损伤后的大鼠肝细胞存活率逐渐增加,且呈浓度依赖性。但浓度上升至10μmol/L时细胞活力不再升高,呈现下降趋势。在同样浓度下淫羊藿素提高肝细胞存活率的能力大约是淫羊藿苷的两倍。2淫羊藿素对CCL4损伤大鼠肝细胞后培养上清ALT、AST的影响:淫羊藿素可减少ALT、AST的释放,在0.1uM-10uM范围内呈剂量依赖关系。淫羊藿素0.1uM,1uM,10uM组与模型组比较显著降低（P<0.05）,淫羊藿苷10uM组与模型组比较显著降低（P<0.01）。淫羊藿素10uM组与淫羊藿苷10uM组比较降酶作用更强,前者约为后者的两倍。3淫羊藿素对CCL4损伤大鼠肝细胞后MDA、SOD及ROS的影响:淫羊藿素在0.1～100uM剂量范围内,可降低培养上清MDA的含量,并恢复肝细胞的SOD活性,且呈明显的剂量依赖性。淫羊藿素减少活性氧簇的产生,相对于Icariin10uM组,Icaritin10uM组的ROS荧光度更低。4淫羊藿素对CCL4损伤肝细胞后PPAR-α和L-FABP影响:不同浓度的淫羊藿素作用不同时间大鼠肝细胞内PPAR-α、L-FABP蛋白的表达逐渐增多,且呈药物浓度与时间依赖性。Western-blot、细胞免疫组化方法均显示正常对照组PPAR-α、L-FABP有一定水平的表达,CCL4损伤后表达下降,而1uM淫羊藿素组的表达则显著增高,1uM Icaritin+ICI182,780组表达则显著降低（P<0.01）。5淫羊藿素对CCL4损伤大鼠肝细胞凋亡相关蛋白及其细胞凋亡比率的影响:模型组、载体组的Bcl-2/Bax明显下降,而给予不同浓度淫羊藿素作用后,Bcl-2/Bax呈升高表现,其趋势呈剂量依赖性。ICI182,780阻断后,Bcl-2/Bax比值明显下降（P<0.05）。流式细胞仪及TUNNEL法检测显示1uM Icaritin处理后细胞凋亡率显著低于模型组与DMSO载体对照组（P<0.01）。1uM Icaritin组细胞凋亡率明显低于1uM Icaritin+ICI182,780组（P<0.05）。体内实验1淫羊藿素对急性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响: 1mg/Kg淫羊藿素组的ALT、AST低于模型组、载体组、Estrogen组（P<0.05）,1mg/Kg Icaritin+ICI182,780组与1mg/Kg Icaritin组比较ALT、AST有显著升高（P < 0.01）。2淫羊藿素对急性肝损伤小鼠肝组织MDA、SOD的影响: 1mg/Kg Icaritin组与Estrogen组比较,MDA、SOD显著差异（P<0.05）。Icaritin+ICI182,780组与1mg/Kg Icaritin组比较差异显著（P < 0.05）。3淫羊藿素对急性肝损伤小鼠肝组织PPARα、L-FABPmRNA转录水平的影响:损伤模型组及载体组,PPAR-α未见明显变化,而L-FABP呈一定程度的下降（与对照组比较P<0.05）。在1mg/Kg Icaritin组二者转录水平均显著增高（P<0.01）。E2组的PPAR-α、L-FABP的转录水平亦较模型组及载体组明显升高（P<0.01）,并且高于Icaritin组,但二者无显著差异（P>0.05）。在ICI182780组,PPAR-α、L-FABP的转录水平较Icaritin组、雌激素组明显下降（P<0.01）。L-FABP抗体免疫组织化学染色结果显示,模型组及载体组的染色范围及染色强度弱于较对照组。而1mg/Kg淫羊藿素组、雌激素组表达则明显增强（P<0.01）,1mg/Kg淫羊藿素+ICI182,780组则减弱（P<0.01）。4淫羊藿素对急性肝损伤小鼠肝组织损伤程度的影响:模型组和载体组小鼠肝损伤组织学积分为3分,而1mg/Kg淫羊藿素组、雌激素组积分分别为0.8,1.2分,与模型组与载体组比较差异显著（P<0.01）,淫羊藿素+ICI182,780组的积分为1.4分,与1mg/Kg淫羊藿素组比较有显著差异（P<0.05）。5淫羊藿素对急性肝损伤小鼠肝组织的凋亡指数变化:1mg/Kg淫羊藿素组肝细胞的凋亡比率明显低于模型组与载体组（P<0.01）。1mg/Kg淫羊藿素+ICI182,780组凋亡数量显著增多,凋亡率明显高于淫羊藿素与雌激素处理组（P<0.05）。[结论]1淫羊藿素有较强的瘁灭活性氧簇的药理作用,可以减轻肝细胞过氧化损伤。2淫羊藿素可通过拟雌激素作用上调肝细胞内L-FABP蛋白的表达,从而通过基因途径提高肝细胞的抗氧化能力。3淫羊藿素可通过上调Bcl-2/Bax比值减轻氧化损伤诱导的肝细胞凋亡。4淫羊藿素是一种有效、多靶点的减轻急性肝损伤的单体药物。总之,本论文以CCL4诱导的大鼠肝细胞及小鼠急性肝损伤为实验模型,应用多种方法研究了淫羊藿素在体内外抗氧化、抗肝细胞凋亡的功能,初步探讨了淫羊藿素治疗急性肝损伤可能涉及的作用机制,为淫羊藿素用于临床提供了实验支持。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写索引
• 前言
• 4 致大鼠肝细胞损伤的实验研究'>第一部分 淫羊藿素减轻 CCL₄致大鼠肝细胞损伤的实验研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要化学药品和生物试剂
• 1.1.2 实验动物
• 1.1.3 主要溶液的配制
• 1.1.4 主要实验仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 大鼠肝细胞的获取及培养
• 1.2.1.1 二步胶原酶灌流法获取大鼠肝细胞
• 1.2.1.2 大鼠肝细胞的活力鉴定及培养
• 1.2.1.3 大鼠肝细胞损伤模型的建立
• 1.2.2 样本分组及药物处理流程
• 1.2.3 MTT 法测定大鼠肝细胞活力
• 1.2.4 自动生化分析仪测定大鼠肝细胞培养上清 ALT、AST
• 1.2.5 分光光度法测定大鼠肝细胞 MDA 含量、SOD 活力
• 1.2.6 荧光显微镜观察大鼠肝细胞ROS 的变化
• 1.2.7 统计学处理
• 2 结果
• 2.1 大鼠肝细胞的活力鉴定及培养结果
• 4 损伤模型结果'>2.2 大鼠肝细胞CCL₄损伤模型结果
• 4 损伤大鼠肝细胞存活率的影响'>2.3 淫羊藿素对CCL₄损伤大鼠肝细胞存活率的影响
• 4 损伤大鼠肝细胞培养上清ALT、AST 的影响'>2.4 淫羊藿素对CCL₄ 损伤大鼠肝细胞培养上清ALT、AST 的影响
• 4 损伤大鼠肝细胞大鼠肝细胞 MDA、SOD 的影响'>2.5 淫羊藿素对 CCL₄ 损伤大鼠肝细胞大鼠肝细胞 MDA、SOD 的影响
• 4 损伤大鼠肝细胞大鼠肝细胞 ROS 的影响'>2.6 淫羊藿素对 CCL₄ 损伤大鼠肝细胞大鼠肝细胞 ROS 的影响
• 3 讨论
• 3.1 大鼠肝细胞分离培养的意义及技术要点
• 3.2 大鼠肝细胞四氯化碳损伤模型的建立及损伤机理
• 3.3 淫羊藿素抗氧化机理及其应用价值
• 4 致大鼠肝细胞凋亡的实验研究'>第二部分 淫羊藿素减轻 CCL₄致大鼠肝细胞凋亡的实验研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要化学药品、生物试剂
• 1.1.2 抗体
• 1.1.3 大鼠肝细胞
• 1.1.4 主要溶液的配制
• 1.1.5 主要实验仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 细胞分离与培养
• 1.2.2 大鼠肝细胞 CCL4 凋亡模型的制作
• 1.2.3 流式检测细胞凋亡数目
• 1.2.4 细胞蛋白裂解液制备和 Western blot 分析
• 1.2.5 培养细胞免疫化学染色检测
• 1.2.5.1 玻片处理
• 1.2.5.2 细胞爬片
• 1.2.5.4 免疫化学染色
• 1.2.6 TUNNEL 法凋亡形态学检测
• 1.2.7 统计学处理
• 2 结果
• 2.1 大鼠肝细胞 CCL4 凋亡模型的制作结果
• 2.2 PPAR-α、L-FABP、Bcl-2/Bax 蛋白的表达
• 2.2.1 不同浓度淫羊藿素作用于大鼠肝细胞不同时间后 PPAR-α、L-FABP 蛋白的表达
• 4 损伤大鼠肝细胞 PPAR-α、L-FABP 蛋白的表达'>2.2.2 淫羊藿素作用于 CCL₄ 损伤大鼠肝细胞 PPAR-α、L-FABP 蛋白的表达
• 2.2.3 Bcl-2/Bax 凋亡相关蛋白的表达
• 2.2.4 不同浓度药物作用后 L-FABP 蛋白的免疫组织化学结果
• 2.3 流式细胞仪检测结果
• 2.4 培养细胞凋亡形态学检测结果
• 3 讨论
• 4 致大鼠肝细胞凋亡的机理'>3.1 CCL₄致大鼠肝细胞凋亡的机理
• 3.2 淫羊藿素拟雌激素样药理作用的理论基础
• 3.3 淫羊藿素调节 PPAR-α蛋白表达的意义及可能机理
• 3.4 淫羊藿素可通过拟雌激素受体样作用调节肝细胞L-FABP 的蛋白表达
• 3.5 L-FABP 抗氧化损伤的机理
• 3.6 淫羊藿素可上调 Bcl-2/Bax 比率减轻受损肝细胞的凋亡
• 4 诱导急性肝损伤的动物实验研究'>第三部分 淫羊藿素减轻 CCL₄诱导急性肝损伤的动物实验研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要试剂和抗体
• 1.1.2 实验动物
• 1.1.3 实验仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 去势动物及急性肝损伤模型的制作
• 1.2.2 动物分组
• 1.2.3 血清ALT、AST 的测定
• 1.2.4 肝组织MDA、SOD 的测定
• 1.2.5 Realtime-PCR 测定肝组织 PPAR-α、L-FABP 转录水平
• 1.2.6 常规病理切片 HE 染色
• 1.2.7 免疫化学染色检测肝组织 L-FABP 的蛋白表达
• 1.2.8 TUNNEL 法检测肝组织凋亡细胞比率
• 1.2.9 统计学处理
• 2 结果
• 4 损伤小鼠血清ALT、AST 的影响'>2.1 淫羊藿素对CCL₄ 损伤小鼠血清ALT、AST 的影响
• 4 损伤小鼠肝组织 MDA、SOD 的影响'>2.2 淫羊藿素对 CCL₄ 损伤小鼠肝组织 MDA、SOD 的影响
• 4 损伤小鼠肝组织PPAR-α、L-FABP 转录水平的影响'>2.3 淫羊藿素对CCL₄ 损伤小鼠肝组织PPAR-α、L-FABP 转录水平的影响
• 4 损伤小鼠肝组织 L-FABP 蛋白表达的影响'>2.4 淫羊藿素对CCL₄ 损伤小鼠肝组织 L-FABP 蛋白表达的影响
• 4 损伤小鼠肝组织 HE 染色观察与评估'>2.5 淫羊藿素对 CCL₄ 损伤小鼠肝组织 HE 染色观察与评估
• 4 损伤小鼠肝组织凋亡细胞比率的影响'>2.6 淫羊藿素对 CCL₄损伤小鼠肝组织凋亡细胞比率的影响
• 3 讨论
• 3.1 迫切需要发现新的减轻急性肝损伤的药物
• 3.2 淫羊藿素的保肝降酶作用
• 3.3 淫羊藿素的减轻肝细胞脂质过氧化损害的作用
• 3.4 淫羊藿素调控肝细胞 L-FABP 转录的作用与意义
• 4 损伤肝细胞凋亡的作用'>3.5 淫羊藿素减轻 CCL₄损伤肝细胞凋亡的作用
• 3.6 淫羊藿素具有治疗急慢性肝损伤及肝脏纤维化的巨大潜能
• 全文小结
• 参考文献
• 综述 1 氧应激与细胞信号转导
• 综述 2 肝型脂肪酸结合蛋白研究进展
• 在读期间撰写发表论文和参加科研工作情况
• 致谢