大麦芽淀粉酶分类评价及极限糊精酶纯化研究

论文摘要

大麦芽中含有三种重要的淀粉水解酶:α-淀粉酶、β-淀粉酶和极限糊精酶。α-淀粉酶可将淀粉分子链内的α-1,4葡萄糖甙键任意水解;β-淀粉酶的作用机理是从非还原性末端的第二个α-1,4葡萄糖甙键开始降解淀粉分子;极限糊精酶专门水解支链淀粉和分支糊精中的α-1,6糖甙键。三种酶协同作用方可将大麦芽中淀粉降解为各种小分子糖,因此有必要对上述不同淀粉酶进行分类评价,掌握其作用特性和规律,为进一步后续研究与工作提供良好的基础。同时,由于极限糊精酶含量较低、检测方法不完善,对其实际作用价值也存在不同观点,因此分离纯化极限糊精酶并探索其结构和特性无疑具有重要的理论意义。本文以大麦芽为原料,分别研究了α-淀粉酶、β-淀粉酶和极限糊精酶最适温度、pH值和热稳定性。分析了多种麦芽品种间三种淀粉酶含量的差异,并建立淀粉酶与麦芽品质之间的关联性。结果表明:水解体系中α-淀粉酶最适作用温度为70℃,pH值5.5;β-淀粉酶为60℃,pH值5.5;极限糊精酶为55℃,pH值5.0。极限糊精酶热稳定性相对较差,55℃下酶失活率随作用时间的延长显著增高。α-淀粉酶、β-淀粉酶和极限糊精酶活力与糖化力呈显著正相关。β-淀粉酶活力与蛋白质和库尔巴哈值呈正相关。采用程序升温糖化法进行小型糖化试验,研究了α-淀粉酶、β-淀粉酶和极限糊精酶在糖化过程中的作用、热稳定性与发酵性能的关系。主要结论为:β-淀粉酶活力水平及其热稳定性是决定发酵性能的主要因素。α-淀粉酶活力水平对发酵性能的影响较大,但热稳定性的影响不明显。极限糊精酶活力水平及热稳定性对发酵性能有显著影响。通过回归分析,得到发酵性能与麦芽特性之间的回归方程。研究提取温度、时间、pH值、料液比和还原剂用量等因素对极限糊精酶提取效果的影响,并采用Box-Behnken中心组合实验和响应面分析法,对提取工艺进行优化。利用Design expert软件分析结果为:极限糊精酶最优提取工艺参数为料液比1:5.37,温度37.5℃,pH值5.4,时间17.5h,还原剂用量22.30mmol/L。对优化工艺条件下提取的极限糊精酶利用离子交换层析和凝胶过滤法进行纯化处理。结果表明:纯化倍数为31.23,回收率为8.81%。经电泳后,表明样品具有较高的纯度,肽链分子量约为97kDa。采用红外光谱、氨基酸组分分析等技术对极限糊精酶结构进行初步探讨,认为其二级结构以β-折叠为主,主要氨基酸组分为酪氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、亮氨酸和天冬氨酸。研究了纯化后极限糊精酶在不同作用环境下活性,发现纯化后样品在温度45℃和pH值5.5左右具有最大活性,与粗酶液中酶活具有明显差异。通过在体系中添加不同浓度的金属离子,结果发现,在金属离子浓度较低时,Mg2+、Ca2+、Mn2+对酶活具有激活作用,离子浓度较高时,则有抑制作用;整体上,K+对酶活影响不大;Zn2+、Fe2+对酶活具有抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 麦芽中主要淀粉酶
• 1.1.1 α-淀粉酶概述
• 1.1.2 β-淀粉酶概述
• 1.1.3 极限糊精酶概述
• 1.2 淀粉酶活性水平差异及其与麦芽品质关系
• 1.2.1 淀粉酶活性水平品种间和环境间的差异性
• 1.2.2 淀粉酶活性水平与麦芽品质关系
• 1.3 淀粉酶热稳定性
• 1.4 极限糊精酶国内外研究现状
• 1.5 立题依据及研究的主要内容
• 1.5.1 立题依据及意义
• 1.5.2 主要研究内容
• 第二章 大麦芽淀粉酶基本特性及与麦芽品质的关系
• 2.1 材料与设备
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验设备
• 2.1.3 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 淀粉酶活力测定方法
• 2.2.2 温度和pH值对淀粉酶活性的影响
• 2.2.3 麦芽品质指标的测定
• 2.2.4 数据分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 两种测定淀粉酶活力方法的比较
• 2.3.2 温度对淀粉酶活性的影响
• 2.3.3 pH值对淀粉酶活性的影响
• 2.3.4 淀粉酶的热稳定性
• 2.3.5 麦芽淀粉酶与麦芽品质的关系
• 2.4 本章小结
• 第三章 大麦芽淀粉酶热稳定性及与发酵性能的关系
• 3.1 材料与设备
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验设备
• 3.1.3 主要试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 麦芽汁的制备
• 3.2.2 麦芽汁的发酵
• 3.2.3 可发酵性糖组分的测定
• 3.2.4 α-淀粉酶、β-淀粉酶和极限糊精酶活性测定
• 3.2.5 α-淀粉酶、β-淀粉酶和极限糊精酶热稳定性的测定
• 3.2.6 酒精度和发酵度的测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 糖化过程中麦汁比重的变化
• 3.3.2 糖化过程中可发酵性糖含量变化
• 3.3.3 糖化过程中可发酵性糖组成比例变化
• 3.3.4 糖化过程中淀粉酶活力的变化
• 3.3.5 淀粉酶热稳定性差异
• 3.3.6 淀粉酶活力与热稳定性之间的关系
• 3.3.7 淀粉酶与发酵性能的关系
• 3.4 本章小结
• 第四章 大麦芽极限糊精酶提取条件优化
• 4.1 材料与设备
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验设备
• 4.1.3 实验试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 单因素实验
• 4.2.2 数据处理与分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 料液比对极限糊精酶提取效果的影响
• 4.3.2 温度对极限糊精酶提取效果的影响
• 4.3.3 pH值对极限糊精酶提取效果的影响
• 4.3.4 提取时间对极限糊精酶提取效果的影响
• 4.3.5 还原剂用量对极限糊精酶提取效果的影响
• 4.3.6 响应面优化
• 4.4 本章小结
• 第五章 大麦芽极限糊精酶分离纯化及酶学特性分析
• 5.1 材料与设备
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验设备
• 5.1.3 实验试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 极限糊精酶分离纯化
• 5.2.2 蛋白质测定
• 5.2.3 SDS-PAGE分析
• 5.2.4 红外光谱分析
• 5.2.5 氨基酸组分分析
• 5.2.6 极限糊精酶酶学特性
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 极限糊精酶的分离纯化
• 5.3.2 极限糊精酶结构鉴定
• 5.3.3 氨基酸组分分析
• 5.3.4 极限糊精酶作用特性
• 5.4 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件