斑马鱼胚胎早期发育过程中TGFβ信号的转导与功能

论文摘要

TGFβ家族的信号转导由TGFβ受体ALK4或ALK7介导,在脊椎动物胚胎的中胚层和内胚层诱导以及神经外胚层的前-后轴线分化中起着重要作用。母体来源的这些TGFβ信号在胚胎发育的什么时期被激活、如何影响胚胎的发育,一直没有明确的答案。SB-431542是一种小分子化合物,在培养的哺乳动物细胞中的实验表明,它能够特异性地阻断ALK4、ALK5、ALK7介导的TGFβ信号的转导。本研究证明,SB-431542在斑马鱼体内同样可以特异性地抑制ALK4、ALK7介导的TGFβ信号。主要证据包括:首先,SB-431542处理的斑马鱼胚胎在表型上与Nodal缺失的突变体的表型类似;其次,SB-431542可以抑制响应Activin/TGFβ的荧光酶报告系统在斑马鱼体内的表达,而对响应ΒΜP的荧光酶报告系统在斑马鱼体内的表达则无抑制作用;第三,SB-431542可以抑制在斑马鱼体内过量表达activin或sqt对中胚层标记基因的诱导作用,但不抑制过量表达bmp2对腹部外胚层标记基因gata2的诱导作用;第四,在SB-431542存在的情况下,过量表达smad3a和smad3b引起的gsc的表达增强受到抑制;第五,SB-431542处理导致的表现型可以被持续激活型的Smad2蛋白所逆转。为了确定斑马鱼中母源TGFβ信号的激活时间,本研究用50μM SB-431542在中囊胚过渡期前（即合子基因开始表达之前）的不同时期处理胚胎,随后观察胚胎形态和检测分子标记的变化。结果说明,诱导中胚层发育的母源TGFβ信号在受精后就开始激活,并在合子基因表达之前不断地传导其信号。当用SB-431542短时间处理卵裂期胚胎,24小时的胚胎仍表现出中轴组织发育缺陷,说明合子基因表达前激活的母源TGFβ信号是胚胎正常发育所必不可少的。本实验还证明中囊胚过渡期前激活的母源TGFβ信号不足以保证胚胎的正常发育,其正常发育还需要中囊胚过渡期后激活的TGFβ信号。此外,本研究还从缺失Nodal信号的MZoep突变体、过量表达Nodal基因sqt的胚胎、以及野生型胚胎中提取mRNA,与斑马鱼基因芯片杂交,发现了许多受Nodal信号调控的基因,为深入研究Nodal信号调控胚胎发育的机理打下了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 斑马鱼胚胎发育过程
• 1.1.1 受精卵时期（Zygote period）
• 1.1.2 卵裂期（cleavage period）
• 1.1.3 囊胚期（blastula period）
• 1.1.4 原肠胚期（gastrula period）
• 1.1.5 体节期（segmentation period）
• 1.1.6 咽胚期（pharyngula period）
• 1.2 TGFβ信号通路
• 1.2.1 TGFβ信号的概述
• 1.2.1.1 TGFβ信号的配体
• 1.2.1.2 TGFβ信号的受体
• 1.2.1.3 Smad 家族
• 1.2.1.4 TGFβ信号的抑制因子
• 1.2.1.5 TGFβ信号通路中各种因子的关系
• 1.2.1.6 TGFβ信号转导过程
• 1.2.2 组织中心（organizer）和中胚层诱导发育的研究
• 1.2.3 Activin 对中胚层的诱导作用
• 1.2.4 Nodal 信号通路对胚胎发育的影响
• 1.2.4.1 Nodal 信号通路的组成
• 1.2.4.2 Nodal 信号通路在胚胎发育过程中的作用
• 1.2.5 斑马鱼中Nodal 信号对于胚胎发育的影响
• 1.2.5.1 中胚层发育诱导
• 1.2.5.2 左右不对称发育调控
• 1.2.5.3 神经命运调控
• 1.3 母源基因
• 1.4 SB-431542
• 1.5 基因芯片
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 斑马鱼品系及其喂养
• 2.1.1 野生型斑马鱼的品系及喂养
• 2.1.2 MZoep 胚胎的获得
• 2.2 SB-431542 处理胚胎
• 2.2.1 SB-431542 的溶解
• 2.2.2 SB-431542 处理胚胎
• 2.3 整胚原位杂交
• 2.3.1 标记探针
• 2.3.1.1 材料
• 2.3.1.2 方法
• 2.3.2 整胚原位杂交
• 2.3.2.1 材料
• 2.3.2.2 方法
• 2.4 显微注射
• 2.4.1 注射m RNA 的制备
• 2.4.1.1 材料和试剂
• 2.4.1.2 方法
• 2.4.2 注射DNA 的制备
• 2.4.3 注射用Smad2MH2 蛋白来自陈晔光教授实验室
• 2.5 斑马鱼总RNA 的提取
• 2.6 荧光酶报告实验
• 2.6.1 载体DNA 与报告DNA 的混合
• 2.6.2 DNA 的注射
• 第3章 TGFβ抑制剂SB-431542 在斑马鱼体内的特异性
• 3.1 SB-431542 可以抑制斑马鱼胚胎Nodal 信号的活性
• 3.2 SB-431542 可以抑制Oep－非依赖性信号的活性
• 3.3 SB-431542 体内抑制作用的专一性
• 3.4 SB-431542 专一作用于体内由ALK4/ALK7 转导的TGFβ信号
• 3.5 SB-431542 阻断Smad2/3 传递的信号
• 3.6 小结
• 第4章 SB-431542 影响中胚层和神经外胚层的形成
• 4.1 不同浓度SB-431542 对胚胎表型的影响
• 4.2 不同浓度SB-431542 对组织特异基因表达的影响
• 4.3 SB-431542 对其它组织特异性基因表达的影响
• 4.4 小结
• 第5章 母源TGFβ信号的激活及其在中胚层发育中的作用
• 5.1 母源TGFβ信号是维持gsc 表达所必需的
• 5.2 母源TGFβ信号的激活时期
• 5.3 母源TGFβ信号的激活及其在中轴中胚层图式形成中的功能
• 5.4 母源TGFβ信号的激活及其对体节形成的影响
• 5.5 早期激活的母源TGFβ信号不足以保证胚胎的正常发育
• 5.6 母源TGFβ信号对心脏发育的影响
• 5.7 讨论
• 5.8 小结
• 第6章 利用基因芯片技术筛选斑马鱼胚胎中受Nodal 信号调控的基因
• 6.1 实验过程
• 6.1.1 总RNA 的制备
• 6.1.2 探针的制备及杂交
• 6.2 实验结果
• 6.2.1 MZoep 突变体胚胎与野生型胚胎中表达差异基因的分子功能分类
• 6.2.2 sqt 过量表达胚胎与野生型胚胎中表达差异基因的分子功能分类
• 6.3 受Nodal 信号调控的有转录调节功能的基因
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果