人疱疹病毒8型基因工程抗原的制备和应用

论文摘要

目的 构建人疱疹病毒8型（HHV8）小衣壳蛋白（ORF65）的原核高效表达克隆,制备用于HHV8感染血清学诊断的基因工程抗原。 方法 应用BCBL-1细胞（HHV8阳性而EBV阴性）制备粗提细胞抗原,并用Sephadex G-75层析柱初步纯化,获得HHV8细胞工程抗原。应用PCR技术扩增HHV8 ORF65编码区,PCR产物与原核表达载体pThioHisA分别双酶切后连接,转化宿主菌E.coli BL21,IPTG诱导融合蛋白表达,经带有6个组氨酸标签的亲和层析柱纯化获得基因工程抗原,Western blot检测其抗原性和特异性。选择最适抗原浓度包被96孔ELISA反应板,对相关病人进行检测,并与Biotrin公司生产的HHV8 IgM和HHV8 IgG抗体IFA检测试剂盒和Qiagen公司ELISA检测试剂盒进行比较。 结果 HHV8 ORF65小衣壳蛋白可在E.coli BL21中高效表达,Western blot检测结果表明该融合蛋白可与5份HHV8特异性IgM阳性血清的4份（80%）和所有10份（100%）HHV8特异性IgG阳性血清发生反应,而10份阴性血清均不与之发生反应。基因工程抗原的各项技术指标与Biotrin公司和Qiagen公司检测试剂盒有较好的符合率。 结论 HHV8 ORF65重组蛋白具有良好的抗原性和特异性,进一步完善后可用于HHV8感染的临床检测,为进一步研制开发新型HHV8诊断试剂提供了有价值的理论和实验依据。

论文目录

• 前言
• 第一章 材料和方法
• 1 主要仪器和试剂
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要试剂配置
• 2 细胞和病毒的培养及收获
• 3 目的基因的获得、纯化和鉴定
• 3.1 目的基因的选择和PCR引物的设计合成
• 3.2 HHV8 DNA模板的制备
• 3.3 PCR扩增
• 3.4 PCR扩增产物的纯化
• 3.5 目的基因的序列测定
• 4 HHV8 ORF65原核重组表达质粒的构建
• 4.1 目的基因及载体pThioHisA的酶切及回收
• 4.2 载体与目的基因的连接
• 4.3 重组质粒的转化
• 4.4 重组原核表达质粒的筛选及鉴定
• 5 重组克隆的诱导表达及表达蛋白的检测
• 6 重组融合蛋白的纯化
• 7 重组蛋白抗原性分析
• 7.1 HHV8 IgG和IgM阳性血清的筛选
• 7.1.1 标本的采集
• 7.1.2 IFA法检测血清标本中HHV8 IgG、IgM
• 7.2 Western印迹检测重组融合蛋白的特异性
• 7.3 包被ELISA板进行抗原性分析
• 8 与同类产品比较
• 第二章 结果
• 1 目的基因的PCR扩增
• 2 原核重组表达质粒的筛选鉴定
• 3 目的基因的序列鉴定
• 4 表达重组融合蛋白的检测
• 5 表达融合蛋白的纯化
• 6 重组蛋白抗原性分析
• 7 ELISA试验结果
• 7.1 与同类产品比较的结果
• 第三章 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述
• 一 HHV-8基因组结构
• 二 HHV-8与趋化因子
• 三 HHV-8的致病性与免疫性
• 四 HHV-8相关疾病以及血清流行病学特点
• 五 HHV-8的实验室诊断
• 参考文献
• 学位论文独创性声明