白扁豆多糖对体外培养的胎鼠大脑皮层神经细胞缺氧性凋亡的保护性研究

论文摘要

目的：通过研究补气类中药白扁豆多糖对体外培养的胎鼠大脑皮层神经细胞缺氧诱导的凋亡的保护机制,进而为临床使用白扁豆多糖防治脑中风及缺血／缺氧性脑病等疾病提供理论依据。方法：1.应用神经细胞专用培养基"NeurobasalTM-A培养液”加"B27 Supplement"进行神经细胞体外无血清培养；2.通过神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE）及胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acid protern, GFAP）对培养6d的神经细胞进行免疫细胞化学法染色,观察神经元细胞及神经胶质细胞的比例；3.采用MTT法观察白扁豆多糖对培养4d的神经细胞作用48h后的毒性作用,初步筛选出白扁豆多糖抗神经细胞缺氧损伤的浓度范围；4.通过Trypan blue拒染法检测神经细胞活力,观察缺氧时间与神经细胞存活率间的关系,判断最适缺氧时间；5.神经细胞正常培养4d后,加入终浓度为0～8mg/ml白扁豆多糖预处理2h,再缺氧12h复氧培养48h后,行MTT测定,观察白扁豆多糖抗神经细胞缺氧性损伤作用,筛选出白扁豆多糖抗神经细胞凋亡实验的药物浓度；6.白扁豆多糖抗神经细胞凋亡实验分组：（1）正常对照组：即在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养；（2）凋亡诱导组：神经细胞常规培养4d,再缺氧12h,复氧培养48h；（3）预处理组：分为白扁豆多糖0.5mg/ml组、3.5mg/ml组、8.0mg/ml组：既神经细胞正常培养4d后,加入终浓度为0.5mg/ml、3.5mg/ml、8.0mg/ml的白扁豆多糖预处理2h,再缺氧12h,复氧培养48h;7.通过Annexin V-FITC染色流式细胞术测定神经细胞凋亡率和坏死率；8.采用DNA琼脂糖凝胶电泳法检测各组凋亡的神经细胞DNA条带；9.采用免疫细胞化学染色法观察凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3表达率的变化。结果：1.胎鼠大脑皮层神经细胞体外无血清培养6d后,神经元约占（92.5±2.20）%,神经胶质细胞约为（7.24±1.15）%;2.白扁豆多糖浓度为1.0mg/ml～6.0mg/ml时有促进神经细胞增殖作用,且呈剂量依赖性,细胞相对增殖率由3.53%升高至28.94%。与正常对照组比较,浓度在2.0mg/ml～6.0mg/ml范围时均有统计学意义（P<0.05）。当浓度为8.0mg/ml时,白扁豆多糖对神经细胞增殖率几乎无影响,而浓度为16.0mg/ml时则有明显的毒性作用,对神经细胞有抑制作用,细胞相对增殖率为-24.16%。3.常规培养4d,缺氧6h、12h、24h再复氧培养48h,神经细胞存活率分别为：（91.40±3.85）%、（78.80±4.15）%、（19.60±3.71）%,与正常对照组（98.80±1.30）%相比,12h、24h有显著性差异（P<0.001）,而6h无统计学差异（P>0.05）。4.0.5mg/ml～8.0mg/ml的白扁豆多糖具有抗神经细胞缺氧性增殖抑制作用,与阳性对照组相比,神经细胞相对增殖率由0提高至59.58%,差异明显（均有P<0.001）;与正常对照组比较,神经细胞相对增殖率由65.04%提高至103.79%。且浓度为1.0mg/ml～4.0mg/ml时,白扁豆多糖抗神经细胞缺氧性增殖抑制作用最为明显。而当白扁豆多糖浓度低于0.5mg/ml或高于6.0mg/ml时,虽然存在抗神经细胞缺氧性增殖抑制作用（与阳性对照组比较P<0.001）,但作用明显下降（与正常组比较P>0.01）。5. AnnexinV-FITC双染流式细胞术检测细胞凋亡结果表明,白扁豆多糖0.5mg/ml、3.5mg/ml、8.0mg/ml组的坏死率分别为（5.26±1.79）%、（4.25±0.99）%、（7.94±1.90）%,与凋亡诱导组（（12.67±1.55）%）及正常对照组（（0.86±0.31）%）比较均有显著性差异（P<0.05）;白扁豆多糖三个浓度组的早期凋亡率分别为（20.93±0.47）%、（4.60±0.43）%、（24.47±1.99）%,与凋亡诱导组（（29.27±1.76）%）及正常对照组（（1.51±0.43）%）比较差异显著（P<0.01）。由此可知,虽然白扁豆多糖具有较强的抗神经细胞缺氧诱导的坏死作用,但效果不十分显著,与凋亡诱导组比较均有P<0.01,与正常对照组比较均有P<0.05。6.DNA琼脂糖凝胶电泳发现凋亡诱导组和白扁豆多糖0.5mg/ml组、8.0mg/ml组可见有明显的凋亡梯状条带,而正常对照组、白扁豆多糖3.5mg/ml组未见有明显凋亡梯状条带。7.Caspase-3免疫细胞化学结果显示,白扁豆多糖0.5mg/ml组、3.5mg/ml组、8.0mg/ml组细胞阳性率分别为（51.33±4.14）%、（44.69±3.79）%、（58.45±5.12）%,与凋亡诱导组（（68.42±4.81）%）比较均有统计学意义（P<0.01）;与正常对照组（（35.75±3.08）%）比较均有显著性差异（P<0.01）。8.Bcl-2免疫细胞化学结果显示,白扁豆多糖0.5mg/ml组、3.5mg/ml组、8.0mg/ml组细胞阳性率分别为（52.49±3.58）%、（61.91±6.46）%、（47.58±3.17）%,与凋亡诱导组（（33.05±5.20）%）比较均有统计学意义（P<0.01）;与正常对照组（（64.35±3.81）%）比较,0.5mg/ml组及8.0mg/ml组均统计学意义（P<0.01）,而3.5mg/ml组无显著性差异（P>0.05）。9.Bax免疫细胞化学结果显示,白扁豆多糖0.5mg/ml组、3.5mg/ml组、8.0mg/ml组细胞阳性率分别为（63.02±2.23）%、（58.74±4.15）%、（66.19±3.42）%,与凋亡诱导组（（59.52±3.63）%）比较,8.0mg/ml组无统计学意义（P>0.05）,而0.5mg/ml组及3.5mg/ml组差异明显（P<0.05）;与正常对照组（（70.40±3.25）%）比较,8.0mg/ml组有统计学意义（P<0.05）,而0.5mg/ml组及3.5mg/ml组无明显差异（P>0.05）。10.白扁豆多糖0.5mg/ml组、3.5mg/ml组、8.0mg/ml组其Bcl-2/Bax比值分别为：0.84±0.05、1.05±0.05、0.72±0.07,与凋亡诱导组（0.474±0.06）比较均有统计学意义（P<0.001）;与正常对照组（1.10±0.09）比较,3.5mg/ml组无明显差别（P>0.05）,0.5mg/ml组及8.0mg/ml组均有统计学意义（P<0.001,P<0.001）。结论：本研究采用多种不同的方法研究了白扁豆多糖对体外培养的胚鼠大脑皮层神经元缺氧性坏死和凋亡的保护作用,结果发现：1.白扁豆多糖浓度低于8.0mg/ml时对体外无血清培养的胎鼠大脑皮层神经细胞无明显毒性作用；1.Omg/ml～6.0mg/ml时均有抗体外培养的胎鼠大脑皮层神经细胞缺氧性增殖抑制作用。2.白扁豆多糖浓度在0.5mg/ml～8.0mg/ml浓度范围时具有抑制缺氧诱导的胎鼠大脑皮层神经细胞凋亡作用,其最大凋亡作用为3.5mg/ml。3.白扁豆多糖浓度抗凋亡机制是通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2及下调促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达,提高Bcl-2/Bax比值而发挥抗神经细胞缺氧性凋亡作用。4.本研究又为中药同一药性功效相同或相近的假设提供了新的实验依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 主要实验试剂、材料与仪器
• 2.2 试剂配制和实验方法
• 第3章 结果
• 3.1 形态学观察
• 3.2 胎鼠大脑皮层神经细胞原代培养中的神经细胞含量
• 3.3 不同浓度的白扁豆多糖对正常培养的神经细胞增殖作用
• 3.4 缺氧时间与神经细胞活性的关系
• 3.5 不同浓度的白扁豆多糖对神经细胞缺氧复氧培养的影响
• 3.6 流式细胞仪分析白扁豆多糖对神经细胞缺氧性凋亡及坏死的影响
• 3.7 白扁豆多糖对细胞凋亡DNA条带的影响
• 3.8 白扁豆多糖对凋亡蛋白表达的影响
• 第4章 讨论
• 4.1 大脑皮层神经元原代培养
• 4.2 缺氧复氧培养与神经细胞凋亡
• 4.3 白扁豆多糖对神经细胞的作用
• 4.4 白扁豆多糖对DNA及凋亡调控蛋白表达的影响
• 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 不足与展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述
• 参考文献
• 附图