论文摘要
本研究根据GenBank中登录的鸭乙型肝炎病毒（Duck hepatitis B virus，DHBV）的全基因序列，建立了常规PCR和荧光定量PCR两种检测DHBV方法，分别用于DHBV分子流行病学调查和人工感染DHBV疾病模型的建立。并利用建立的疾病模型筛选和评估抗乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）新药物的研究。 针对DHBV的保守序列设计1对引物，建立了PCR检测方法，采用该方法检测含DHBV样品能够扩增出215bp预期大小的片段。该方法对鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭源致病性大肠埃希氏菌、鸭源致病性沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌等感染鸭的常见病原都呈阴性反应；检测DHBV核酸的灵敏度可达0.42pg，对天府肉鸭血清检测的阳性率为12.34％（38／326）。该法特异强、灵敏性高，可用于DHBV的快速诊断和分子流行病学调查。 针对DHBV的P基因上的保守序列设计并合成引物和荧光标记探针，建立了实时荧光定量聚合酶链反应（fluorsescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）检测方法。建立的标准曲线循环阈值（cycle threshold，Ct值）与模板浓度具有良好的线性关系，相关系数为0.996，最低可检测5 copies／L的DHBV-DNA，即相当于5个DHBV颗粒。该方法较常规PCR技术更为简便、快速、准确，灵敏度高100倍。 用不同剂量的DHBV阳性血清经不同感染途径人工感染1日龄天府肉鸭（DHBV为阴性），于感染后2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d、16d、19d、22d、26d、31d、37d、44d、52d、60d、70d分别杀鸭无菌取血和肝组织，用所建立的FQ-PCR方法检测肝脏和外周血中DHBV-DNA的含量。结果感染后48h可从外周血和肝组织中检测出DHBV-DNA，到70天仍可检测出较高水平的DHBV-DNA；肝组织中DHBV-DNA含量的整体水平比外周血中高，维持时间也较长。外周血和肝组织中的DHBV-DNA水平与感染剂量呈正相关，并表现出一定的剂量依赖性。天府肉鸭对DHBV敏感，用DHBV阳性血清感染1日龄天府肉鸭可建立DHBV疾病感染模型。 用天府肉鸭DHBV感染模型研究新药PNA对DHBV的抑制作用，在用药前、用药后5天、用药后10天及停药后3天分别采血和肝组织，用FQ-PCR检测血清和肝组织中DHBV—DNA，并用拉米夫定作对照。给药5天、10天时血清和肝组织中DHBV—DNA总体水平显著下降（P＜0.05），停药3天后DHBV-DNA含量较用药时有所回升。PNA给药组和拉米夫定对照组对DHBV-DNA的抑制率差异不显著（P＞0.05）。即PNA能有效降低血