表没食子儿茶素没食子酸酯对小鼠皮肤烫伤创面愈合的影响

论文摘要

烫伤是皮肤创伤的一种常见形式,皮肤创伤修复是一个涉及炎症反应、新组织形成和组织重建的复杂病理生理过程。在这一过程中,有多种组织、修复细胞和细胞外基质及各种细胞调控因子参与其中,其中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）是参与炎症反应的主要细胞因子,对炎症反应的发生、发展以及新组织的形成与组织结构的重建都起到了重要的调节作用。表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate, EGCG）是绿茶多酚的主要成分,具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症反应等特性。有研究表明EGCG能抑制肿瘤细胞TNF-α、IL-1β和MMP-1基因的表达和生成,并促进基质金属蛋白酶抑制因子-1 （tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1）基因的表达,以及由TNF-α、IL-1β、MMP-1和TIMP-1基因诱导的炎症反应。本实验室前期的研究表明EGCG抑制皮肤伤口愈合期间IL-1β的基因表达,降低组织IL-1β的水平,推测EGCG可能具有抑制伤口炎症过度发生、促进皮肤伤口愈合的作用。为探讨EGCG对烫伤皮肤修复的生物学作用及其机制,本研究建立并使用了小鼠烫伤模型,采用形态学、组织学、逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）和酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）方法观察了正常皮肤烫伤的细胞因子的变化并分析了EGCG涂敷引起的烫伤皮肤伤口的变化,并探讨了EGCG对烫伤皮肤修复期间组织TNF-α、IL-1β、MMP-1和TIMP-1基因表达水平及生成的影响,以期为临床运用EGCG改善烫伤皮肤修复提供实验依据。通过形态学和组织学观察可以看出:0.2 mg/g EGCG涂敷处理的小鼠烫伤皮肤伤口首先愈合,说明0.2 mg/g EGCG能促进小鼠烫伤皮肤伤口的愈合。半定量RT-PCR实验结果显示,皮肤烫伤部位涂敷0.2 mg/g EGCG后组织的TNF-α、IL-1β和MMP-1基因表达水平下降,TIMP-1基因表达水平上调;能够抑制损伤部位的TNF-α、IL-1β和MMP-1基因表达,促进TIMP-1基因的表达;和ELISA促进TIMP-1基因的表达;并降低损伤部位TNF-α、IL-1β和MMP-1的含量,说明0.2 mg/g EGCG能够使小鼠烫伤部位TNF-α、IL-1β和MMP-1水平快速恢复到正常水平,也同样说明0.2 mg/g EGCG能够促进小鼠烫伤皮肤伤口的愈合。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 文献综述
• 1 烫伤修复
• 1.1 烫伤修复的基本过程
• 1.2 炎症反应在烫伤愈合中的作用
• 1.3 细胞活性因子在烫伤愈合中的作用
• 1.4 修复细胞在烫伤愈合中的作用
• 1.5 基质金属蛋白酶类在烫伤愈合中的作用
• 2 表没食子儿茶素没食子酸酯
• 2.1 表没食子儿茶素没食子酸酯简介
• 2.2 EGCG 的作用
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 试剂的配制
• 2.2 不同时间不同处理组烫伤小鼠伤口直径的测量
• 2.2.1 实验动物烫伤模型的建立
• 2.2.2 实验动物的分组
• 2.2.3 小鼠伤口长度的测量
• 2.3 不同时间不同处理组小鼠皮肤伤口组织学切片
• 2.3.1 盖玻片和载玻片的处理
• 2.3.2 实验步骤
• 2.3.3 皮肤石蜡切片结果观察保存
• 2.4 总RNA 提取
• 2.4.1 实验用品的RNase-free 处理
• 2.4.2 RNA 提取操作步骤
• 2.4.3 RNA 浓度和纯度检测
• 2.4.4 RNA 完整性检测
• 2.4.5 RNA 琼脂糖凝胶电泳上样量的分析
• 2.4.6 RNA 的保存
• 2.5 逆转录反应
• 2.5.1 试剂的分装
• 2.5.2 操作步骤
• 2.6 小鼠烫伤皮肤MMP-1 基因的PCR 扩增
• 2.6.1 试剂的分装
• 2.6.2 MMP-1 引物
• 2.6.3 操作步骤
• 2.6.4 PCR 产物的电泳检测
• 2.7 小鼠烫伤皮肤TIMP-1 基因的PCR 扩增
• 2.7.1 TIMP -1 引物
• 2.7.2 操作步骤
• 2.7.3 PCR 产物的电泳检测
• 2.8 小鼠烫伤皮肤IL-1β基因的PCR 扩增
• 2.8.1 IL-1β引物
• 2.8.2 操作步骤
• 2.8.3 PCR 产物的电泳检测
• 2.9 小鼠烫伤皮肤TNF-α基因的PCR 扩增
• 2.9.1 TNF-α引物
• 2.9.2 操作步骤
• 2.9.3 PCR 产物的电泳检测
• 2.10 小鼠β-Actin 基因的PCR 扩增
• 2.10.1 小鼠β-actin 基因引物设计
• 2.10.2 实验步骤
• 2.10.3 PCR 产物的电泳检测
• 2.11 ELISA 水平
• 2.11.1 实验设计
• 2.11.2 小鼠组织匀浆的制备
• 2.11.3 小鼠MMP-1 浓度的测定
• 2.12 小鼠IL-1β以及TNF-α的ELISA 检测
• 3 结果
• 3.1 EGCG 对皮肤切口愈合时间的影响
• 3.2 EGCG 对皮肤切口愈合效应的组织学观察
• 3.3 EGCG 对小鼠损伤部位皮肤MMP-1 分泌的影响
• 3.4 EGCG 对小鼠损伤部位皮肤MMP-1 基因表达的影响
• 3.4.1 半定量比较小鼠烫伤皮肤MMP-1 基因表达差异
• 3.5 EGCG 对小鼠损伤部位皮肤TIMP-1 基因表达的影响
• 3.5.1 TIMP-1 基因的RT-PCR 扩增结果
• 3.5.2 半定量比较小鼠损伤皮肤TIMP-1 基因表达差异
• 3.6 EGCG 对小鼠损伤部位皮肤IL-1β分泌的影响
• 3.7 EGCG 对小鼠损伤部位皮肤IL-1β基因表达的影响
• 3.7.1 IL-1β基因的RT-PCR 扩增结果
• 3.7.2 半定量比较小鼠损伤皮肤IL-1β基因表达差异
• 3.8 EGCG 对小鼠损伤部位皮肤TNF-α分泌的影响
• 3.9 EGCG 对小鼠损伤部位皮肤TNF-α基因表达的影响
• 3.9.1 TNF-α基因的RT-PCR 扩增结果
• 3.9.2 半定量比较小鼠损伤皮肤TNF-α基因表达差异
• 4 讨论
• 4.1 EGCG 对皮肤烫伤愈合时间和组织学的影响
• 4.2 EGCG 对MMP-1、IMP-1 分泌和基因表达的影响
• 4.3 EGCG 对 IL-1β和 TNF-α 分泌和基因表达的影响
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录