论文摘要
本实验研究白介素35(interleukin 35, IL-35)基因表达质粒载体联合甲基转移酶抑制剂地西他滨(decitabine)对小鼠免疫功能尤其是CD4+CD25+调节性T细胞表达水平和功能的影响;采用小鼠尾静脉快速注射质粒载体的方法研究体内基因转染效果,筛选相对高效IL-35质粒剂量组;建立稳定的小鼠腹腔异位心脏移植模型,经尾静脉注射IL-35质粒载体协同地西他滨联合干预受体,观察其对受体调节性T细胞表达水平和同种异系小鼠心脏移植排斥反应的影响,探索出诱导移植免疫耐受的新途径。第一部分:IL-35及地西他滨对体外培养的小鼠T淋巴细胞的作用研究目的:酶切鉴定小鼠IL-35质粒载体,探讨体外IL-35和地西他滨对小鼠T淋巴细胞的作用,研究其负向免疫调节作用及机制。方法:酶切鉴定英国格拉斯哥大学惠赠IL-35质粒,设计目的基因IL-35的上下游引物,通过聚合酶链式反应(PCR),合成目的基因IL-35;通过阳离子脂质体转染法,体外转染人肾上皮细胞系293细胞,流式细胞术(FCM)分析细胞转染效率以及酶联免疫吸附法(ELISA)检测转染后细胞上清液中IL-35的浓度,分析IL-35基因表达情况;进行单向混合淋巴细胞培养,观察IL-35及地西他滨处理后对培养体系的影响,以流式细胞技术检测培养体系T细胞亚群和CD4+CD25+Treg比例。结果:IL-35质粒载体鉴定成功;质粒载体转染的细胞上清液中有IL-35表达;IL-35及地西他滨上调体外同种异体混合淋巴细胞反应体系中的CD4+CD25+Treg比例,下调CD4+CD8-T细胞比例。第二部分:IL-35体内基因转染对小鼠免疫功能的影响目的:评价经小鼠尾静脉注射质粒载体方法进行体内转染的效果,探讨IL-35基因转染对小鼠免疫功能的影响,并筛选相对高效IL-35质粒剂量组。方法:设置空质粒对照组和目的基因质粒载体组,经鼠尾静脉流体力学转染质粒载体,体内干预小鼠,流式细胞技术检测转染第3、5、7天后外周血和脾脏组织中T细胞亚群、调节性T细胞、NK细胞比例。结果:经鼠尾静脉注射质粒载体方法可使IL-35目的基因在体内表达;IL-35引起小鼠体内外周血及脾脏CD4+CD25+Treg比例上调,外周血CD4+CD8-T细胞、CD3-CD16+NK细胞比例下调;筛选出IL-35相对高效转染质粒剂量为50ug。第三部分:IL-35基因转染协同地西他滨在同种异系小鼠心脏移植中的抗排斥反应作用研究目的:观察受体小鼠尾静脉注射IL-35质粒载体及地西他滨对同种异系小鼠心脏移植排斥反应的作用,探讨其抗排斥机制。方法:建立小鼠异位腹腔心脏移植模型;设置异系对照组、空质粒对照组、IL-35质粒载体处理组、地西他滨处理组、IL-35质粒协同地西他滨处理组。观察各组移植心脏存活时间,评定术后7天移植物排斥反应病理分级;流式细胞术检测术后7天外周血及脾脏组织T细胞亚群及CD4+CD25+Treg的变化水平。结果:成功构建同种异系小鼠腹腔异位心脏移植模型。与异系对照组(中位生存期8天)和空质粒Fc组(中位生存期7天)相比,IL-35质粒载体处理组(中位生存期10天)、地西他滨处理组(中位生存期11天)和IL-35质粒协同地西他滨处理组(中位生存期12天)移植心脏存活时间明显延长(P<0.01);IL-35质粒载体处理组、地西他滨处理组和IL-35质粒协同地西他滨处理组术后7天移植心的急性排斥反应病理分级较异系对照组明显降低(P<0.01);与异系对照组和空质粒Fc组相比,IL-35质粒载体处理组、地西他滨处理组和IL-35质粒协同地西他滨处理组术后7天外周血和脾脏CD4+CD25+Treg比例均明显升高(P<0.01),外周血CD4-CD8+T细胞水平均明显降低(P<0.01)。结论:小鼠异位腹腔心脏移植模型是研究移植排斥反应的理想动物模型。IL-35及地西他滨对同种异系小鼠心脏移植有抗排斥作用,其机制可能为IL-35及地西他滨刺激CD4+CD25+Treg的生成,抑制效应性T细胞增殖和应答,延长存活时间。IL-35质粒协同地西他滨的基因免疫治疗可能成为新的有效的诱导移植免疫耐受的途径。
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