机械伤害诱导豌豆幼苗防御性反应及其调控机制——着重于茉莉酸和H_2O_2信息的研究

论文题目: 机械伤害诱导豌豆幼苗防御性反应及其调控机制——着重于茉莉酸和H_2O_2信息的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 食品科学与工程

作者: 刘艳

导师: 黄卫东

关键词: 豌豆幼苗,机械伤害,茉莉酸,过氧化氢

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本研究以豌豆（Pisum sativum L）幼苗为试材,探讨了机械伤害诱导豌豆幼苗防御反应产生的机制,重点分析了茉莉酸和过氧化氢（H2O2）作为信号分子的作用及其信号转导过程,主要结果如下: 机械伤害和外源茉莉酸均能诱导豌豆叶片活性氧迸发,以及伤害防御反应PAL、PPO活性提高;相应地,抗氧化酶类活性显著增强,降低膜脂过氧化水平,减轻活性氧损伤。适宜浓度茉莉酸（1～10μmol/L）处理可有效诱导防御反应产生,高浓度茉莉酸（100μmol/L）处理造成豌豆叶片活性氧代谢失调,膜脂过氧化加剧。 利用茉莉酸单克隆抗体,采用胶体金免疫定位技术,进一步观察了茉莉酸在豌豆叶片中的亚细胞分布,以及局部机械伤害后茉莉酸的分布和数量变化。结果显示,茉莉酸在豌豆叶片叶肉细胞和韧皮部中普遍存在,在叶肉细胞的细胞壁和叶绿体中有分布,细胞核和细胞质中也有少量存在。在维管组织中茉莉酸大量分布在韧皮部SE-CC分子细胞壁上,木质部中没有观察到茉莉酸信号。局部机械伤害后,伤害叶片叶肉细胞中茉莉酸积累迅速,邻近叶片中茉莉酸的累积稍有滞后,但在韧皮部SE-CC分子中,无论是伤害叶片还是未伤害的邻近与远端叶片,茉莉酸含量均迅速增加。伤害处理后,茉莉酸合成关键酶LOX和AOS活性提高,但在时间顺序地晚于茉莉酸含量的增加。综合分析认为,伤害早期茉莉酸的重新分配和运输可能是茉莉酸含量局部迅速升高的主要途径,而伤害后期,茉莉酸的从头合成可能是茉莉酸含量增加的来源之一。 进而采用DAB组织染色、CeCl3细胞化学染色和ZiCl4显色等多种方法,跟踪了局部机械伤害和外源茉莉酸处理后H2O2在整株植株的时空动态变化。结果显示,局部机械伤害和外源茉莉酸处理均可以诱导豌豆幼苗H2O2系统性产生,且不同伤害处理叶片H2O2迸发的时刻相近,含量相当。质膜NADPH氧化酶抑制剂可以显著抑制伤害和茉莉酸诱导的H2O2迸发,H2O2的亚细胞定位结果也显示,伤和茉莉酸诱导产生的H2O2主要分布于质膜、细胞壁和细胞间隙,分析认为,质膜NADPH氧化酶可能是氧化突发H2O2形成的关键酶。进一步分析H2O2形成的机制,提取豌豆叶片质膜,测出了质膜NADPH氧化酶活性,且这类NADPH氧化酶活性可以被机械伤害和外源茉莉酸诱导提高,该酶活性动态变化与活性氧产生时间上表现出同步性的特点,该酶抑制剂能有效抑制伤和茉莉酸诱导的H2O2累积以及PAL活性提高;相应地,清除H2O2,伤和茉莉酸诱导的PAL活性提高同样被抑制,表明质膜NADPH氧化酶的活化和H2O2的产生介导了机械伤害和外源茉莉酸诱导的PAL活性提高。伤害和茉莉酸诱导的H2O2产生还涉及Ca2+的内流、CaM和蛋白磷酸化与去磷酸化过程。质子泵活性也可被伤和茉莉酸诱导,这种活性诱导属于翻译后调节,并可能在活性氧进发的上游发挥作用。 本研究首次确认了叶肉细胞和韧皮部中茉莉酸的存在和分布;伤引起茉莉酸的运输、分配变化可能参与对防御反应的调控:质膜NADPH氧化酶是伤诱导活性氧迸发的关键酶,H2O2作为中间信号分子参与伤和茉莉酸诱导的防御反应。

论文目录:

缩略语表

中文摘要

Abstract

第一章 文献综述

1 引言

2 果蔬对机械伤害的适应性响应机制

2.1 次生代谢变化

2.2 细胞壁结构、组分变化

2.3 膜系统变化

2.4 酶促褐变

3 茉莉酸类在植物伤反应中的信号功能

3.1 茉莉酸是伤反应中重要的信号分子

3.2 JA参与的伤信号转导途径

3.3 JA与其它伤信号物质在伤信号转导中的相互关系

4 H_2O_2在植物细胞信号转导中的作用

4.1 植物氧化突发

4.2 H_2O_2氧化信号转导

4.3 H_2O_2是系统信号还是局部信号

5 本研究的目的和意义

第二章 机械伤害和茉莉酸对豌豆(Pisum sativum L.)幼苗膜脂过氧化的影响

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 材料处理

1.3 丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量测定

1.4 过氧化氢(Hydrogen peroxide, H_2O_2)含量测定

1.5 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)、超氧阴离子自由基(Superoxide radical, O_2)产生速率测定

1.6 抗坏血酸过氧化酶(Ascrodate peroxidase, APX)、过氧化物酶(Peroxidase, POD)活性测定

1.7 苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase, PAL)活性测定

1.8 多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)活性测定

2 结果与分析

2.1 机械伤害和JA处理对豌豆幼苗MDA含量的影响

2.2 机械伤害和JA处理对豌豆幼苗O_2~-·和H_2O_2含量的影响

2.3 机械伤害和JA处理后豌豆幼苗保护酶系统的变化

2.4 机械伤害和JA处理对豌豆幼苗PAL和PPO活性的影响

3 讨论

3.1 机械伤害和外施JA与豌豆幼苗膜脂过氧化

3.2 机械伤害和外施JA可以诱导豌豆幼苗防御反应产生

第三章 豌豆(Pisum sativum L.)叶片响应机械伤害的茉莉酸亚细胞区域化分布

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 材料处理

1.3 样品包埋

1.4 免疫染色

1.5 脂氧合酶(Lipoxygenase, LOX)、丙二烯氧化物合成酶(Allene oxide synthase, AOS)活性测定

2 结果

2.1 豌豆叶片细胞中JA的分布

2.2 伤害叶片叶肉细胞以及维管组织中JA分布的变化

2.3 邻近叶片叶肉细胞及维管组织中JA的定位

2.4 远端叶片叶肉细胞及维管组织中JA的定位

2.5 伤胁迫下豌豆叶片LOX、AOS活性变化

3 讨论

3.1 JA免疫组化定位的可行性

3.2 JA在叶片中的定位

3.3 伤胁迫下JA的积累、运输和分配

第四章 机械伤害和外源茉莉酸诱导豌豆(Pisum sativum L.)幼苗H_2O_2系统性产生

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 材料处理

1.3 H_2O_2活体组织化学原位检测

1.4 H_2O_2细胞化学定位

1.5 H_2O_2含量测定

1.6 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧阴离子自由基(O_2)产生速率的测定

1.7 抗坏血酸过氧化酶(APX)活性测定

2 结果与分析

2.1 机械伤害和JA诱导豌豆叶片H_2O_2产生的组织化学定位

2.2 机械伤害和JA诱导豌豆叶片H_2O_2产生的细胞化学定位

2.3 机械伤害对豌豆叶片活性氧与抗氧化酶类活性的影响

3 讨论

第五章 质膜NADPH氧化酶的活化与H_2O_2的产生介导机械伤害诱导豌豆(Pisum sativum L.)幼苗PAL活性提高

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 材料处理

1.3 质膜制备及纯度鉴定

1.4 质膜NAD(P)H氧化酶活性测定

1.5 细胞壁结合态POD和可溶性POD活性测定

1.6 H_2O_2含量测定

1.7 PAL酶活性测定以及SDS-PAGE和Western-blotting

1.8 质膜H~+-ATPase(PM H~+-ATPase)活性测定以及SDS-PAGE和western-blotting

2 结果

2.1 机械伤害诱导H_2O_2产生

2.2 机械伤害对质膜NADPH氧化酶和POD活性的影响

2.3 机械伤害对PAL活性的影响

2.4 机械伤害对质膜H~?-ATPase(PMH~+-ATPase)活性的影响

3 讨论

第六章 质膜NADPH氧化酶参与茉莉酸诱导豌豆(Pisum sativum L.)幼苗PAL活性提高

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 材料处理

1.3 质膜NAD(P)H氧化酶活性测定

1.4 细胞壁结合态POD和可溶性POD活性测定

1.5 H_2O_2含量测定

1.6 PAL酶活性测定以及SDS-PAGE和Western-blotting

1.7 H~+-ATPase活性测定以及SDS-PAGE和Western-blotting

2 结果

2.1 机械伤害对内源JA含量的影响

2.2 外施JA诱导H_2O_2产生

2.2 外施JA对质膜NADPH氧化酶和POD活性的影响

2.3 外源JA对PAL活性的影响

2.4 JA对质膜H~+-ATPase(PM H~+-ATPase)活性的影响

3 讨论

结论与推论

参考文献

致谢

个人简历

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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